Allocation and optimization of whole-cell-catalysts for the bienzymatic synthesis of hydroxycarboxylic acids and hydroxycarboxamides
Organic Molecular Chemistry - Synthesis and Characterisation
Final Report Abstract
Chirale 2-Hydroxynitrile, 2-Hydroxycarboxamide und 2-Hydroxycarbonsäuren stellen interessante Produkte und Synthesebausteine für die chemische Industrie dar. Im Rahmen der von der DFG geförderten Untersuchungen wurden grundlegende Aspekte zur biotechnologischen Herstellung dieser Verbindungsklassen mit Hilfe spezifisch für diese Syntheseleistungen entwickelter rekombinanter Mikroorganismen untersucht. Hierbei wurde die Synthese der optisch aktiven Verbindungen aus einfachen leicht verfügbaren Grundstoffen (Aldehyden, Ketonen, Cyanid) durch rekombinante Escherichia coli Stämme erzielt, die pflanzliche Enzyme (Hydroxynitril Lyasen, Oxynitrilasen) und bakterielle Enzyme (Nitrilasen) gemeinsam expremieren. Hierbei katalysieren die Oxynitrilasen die enantioselektive Addition von Cyanid an Aldehyde und Ketone und die Nitrilasen direkt in der lebenden Zelle die Hydrolyse der gebildeten chiralen 2-Hydroxynitrile zu den korrespondieren chiralen Säuren und Amiden, die dann von den Zellen ausgeschieden werden. Die Untersuchungen zeigten, dass das untersuchte „bienzymatische Kaskadensystem“ sowohl zur Herstellung aliphatischer als auch aromatischer 2-Hydroxycarboxamide und 2-Hydroxycarbonsäuren geeignet ist und zeigten einen Weg zur Synthese von stabilen chiralen quaternären Kohlenstoff-Zentren aus Ketonen auf. Durch ortsgerichtete Mutagenese wurden eine Vielzahl an Enzymvarianten der bakteriellen Nitrilase erzeugt und bezüglich der Reaktions-, Substrat- und Enantiospezifität analysiert. Hierbei konnten Aminosäurereste identifiziert werden, die die Enantioselektivität und Amidbildungsrate der Nitrilasen signifikant beeinflussen. Desweiteren wurde ein invivo Screening-System zur Identifizierung von Amid bildenden Nitrilase-Varianten etabliert und zum erfolgreichen Screening von Mutantenbanken eingesetzt. Die Kombination verschiedener getrennt erhaltener Mutationen in einzelnen Enzymvarianten führte zu einer weiteren Erhöhung der Amidbildungsraten. Auf diese Weise gelang es, die untersuchte Nitrilase in eine Nitril-Hydratase umzuwandeln. Durch die Koexpression der „Amid-bildenden Nitrilase-Varianten“ mit einer Oxynitrilase wurde ein Weg zur enantioselektiven Synthese von 2- Hydroxycarboxamiden aufgezeigt.
Publications
- 2009. Construction of recombinant Escherichia coli catalysts which simultaneously express an (S)-oxynitrilase and different nitrilase variants for the synthesis of (S)-mandelic acid and (S)-mandeloamide from benzaldehyde and cyanide. Adv. Synth. Catal. 351:1531-1538
Sosedov, O., K. Matzer, S. Bürger, C. Kiziak, S. Baum, J. Altenbuchner, A. Chmura, F. van Randwijk & A. Stolz
- 2010. Construction and application of variants of the arylacetonitrilase from Pseudomonas fluorescens EBC191 which form increased amounts of acids or amides. Appl. Environ. Microbiol. 76:3668-3674
Sosedov, O., S. Baum, S. Bürger, K. Matzer, C. Kiziak & A. Stolz
- 2011. Conversion of sterically demanding α-, α−disubstituted phenylacetonitriles by the arylacetonitrilase from Pseudomonas fluorescens EBC191. Appl. Environ. Microbiol.
Baum, S., D.S. Williamson, T. Sewell & A. Stolz
(See online at https://doi.org/10.1128/AEM.05570-11)
