HPLC/ESI-Q-TOF Tandem-Massenspektrometer
Final Report Abstract
Die Kopplung von Ultra-Hochleistungsflüssigchromatographie (engl. Abkürzung UPLC) mit Electrospraylonisierung-Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometrie (engl. Abkürzung ESl-QTOF-MS) stellt eine der leistungsstärksten Methoden für Metabolomics-Untersuchungen dar. Metabolomics meint den Ansatz, möglichst viele Metabolite in einer biologischen Probe zu detektieren und zu quantifizieren. Dies erlaubt analog zu Transkriptom- und Proteom-Analysen eine sehr empfindliche Abbildung des Zustandes eines biologischen Systems. Durch den Vergleich von Proben lassen sich von Umwelteinflüssen oder Entwicklungsprozessen ausgelöste Veränderungen im Stoffwechsel ebenso detektieren wie Auswirkungen des Genotyps. Gerade für die Erforschung der pflanzlichen Biologie mit ihrem auch für den Menschen unmittelbar relevanten, vielfältigen Sekundärstoffwechsel sind Metabotomics-Ansätze eminent wichtig. UPLC-ESl-QTOF-MS erlaubt bei einer Analysenzeit von ca. 20 Minuten die Detektion von Hunderten bis zu einigen Tausend Signalen in einem Extrakt. Diese hochauflösende Analytik wird an der Universität Bayreuth für eine Reihe unterschiedlicher Projekte eingesetzt. Im BMBF-Projekt GABl-Protect wurde das Metabolom von Arabidopsis thaliana-Pflanzen charakterisiert, deren Extrakte in einem Hepatoma-Bioassay Aktivierung von Phase ll-Enzymen ausgelöst haben. Diese Pilotstudie soll eine Methodik etablieren, um in Nahrungspflanzen neue Substanzen mit möglicher chemoprotektiver, d.h. krebsvorbeugender Wirkung zu finden. Verschiedene Projekte untersuchen die Dynamik des pflanzlichen Metaboloms unter Stress. Metabolite Profiling von Gerste-Wildtyp- und tigrina-Pflanzen konnte zeigen, dass die Entstehung von Singulett-Os in der tigrina-Mutante nach Belichtung zu massiven Veränderungen im Metabolom führt. In dunkelangezogenen oder dauer belichteten Pflanzen waren diese Veränderungen nicht zu detektieren und zeigen eine Signalfunktion von Singulett-02 an. In Kooperation mit der Pflanzenökologie Bayreuth werden für eine große Zahl von tropischen Pflanzenarten entlang eines Niederschlagsgradienten die metabolischen Antworten auf Trockenstress charakterisiert, um die Bedeutung dieser Anpassungsleistung für die Vegetationsstruktur verstehen zu lemen. In einem SPP-Projekt wird die ökologische Funktion der Metallhyperakkumulation als Alternative zur chemischen Herbivorabwehr untersucht. Hierzu werden Metabolitenprofile verschiedener kontrastierender Individuen des Metallophyten Arabidopsis halleri gemessen, die sich im Feld drastisch in der Cd-Hyperakkumulation unterscheiden. Ebenso werden die Effekte toxischer Schwermetalle sowie die Wirkungen von Mikronährstoffüberschuss und -mangel untersucht (z.B. Eisenmangel in Ctilamydomonas reinhardtii). Ein DFG-Projekt zielt darauf, u.a. durch das Metabolite Profiling von entsprechenden Mutanten die Aktivität(en) und physiologische Rolle(n) offenbar bifunktionaler (Trans)Peptidasen (Phytochelatinsynthasen) in Arabidopsis thaliana aufeuklären. Phänotypen von Defektmutanten zeigen eine Beteiligung an der Zn-Homöostase ebenso wie einen Beitrag zur angeborenen Immunität. Letzterer wird in Zusammenhang mit einer Aktivität im Glucosinolat-Stoffwechsel gesehen. Putative Substrate und Produkte der Phytochelatinsynthasen sind bislang jedoch unbekannt. Kandidatenmoleküle sollen durch vergleichendes Metabolite Profiling identifiziert werden. In Zusammenarbeit mit Firmen der Lebensmittelindustrie wird die UPLC-ESl-QTOF-MS-Metabolom-Analytik für die Charakterisierung von pflanzlichen Rohstoffen und Produkten erprobt. Die ungerichtete Abbildung von Inhaltsstoffmustem soll etwa für Herkunfts nachweise, die Aufklärung und Überprüfung von Qualitätsmerkmalen wie bestimmten Geschmackseindrücken oder auch die Rückstandsanalytik (Detektion von Verunreinigungen, für die keine Routineüberprüfung durchgeführt wird) eingesetzt werden. Ein zweiter prinzipieller Anwendungsbereich neben dem ungerichteten Profiling liegt in der gezielten, sensitiven Detektion und Quantifizierung von einzelnen Molekülen oder Molekülklassen. Sehr hohe Massengenauigkeit erleichtert die Identifizierung. Dies wird z.B. in der organischen Chemie für die Bewertung von Synthesen eingesetzt (Lehrstuhl für Organische Chemie, Bayreuth: Tetramsäuren, organische Metallkomplexe). Wir haben in einigen Projekten die wichtigen Metallchelatoren Nicotianamin und Phytochelatine quantifiziert und dabei durch heterologe Expression von entsprechenden Biosyntheseenzymen produzierte Isotopen-markierte Standards eingesetzt. In Kooperationen wurden z.ß. Glucosinolate (Pflanze-Bakterien-Interaktion), oder Alkaloide (Pflanze-Insekten-Interaktion) in pflanzlichen Geweben analysiert, Purin-Metabolite in Bakterien oder Phospholipide in der Bäckerhefe.
Publications
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(2009) Phytochelatin synthesis is essential for the detoxification of excess Zn and contributes significantly to the accumulation of Zn. Plant Physiol. 149: 938-948
Tennstedt, P., Peisker, D., Böttcher, C., Trampczynska, A.,Clemens, S.
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(2009) Singlet oxygen-dependent translational control in the tigrina d12 mutant of barley. Proc. Natl. Acad. Sci USA 106:13112-13117
Khandal, D., Samol, I., Buhr, F., Pollmann, S., Schmidt, H., Clemens, S., Reinbothe, S., Reinbothe, C.
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(2010) Nicotianamine forms complexes with Z(II) in vivo. Metallomics 2: 57-66
Trampczynska, A., Küpper, H., Meyer-Klaucke, W., Schmidt, H., Clemens, S.
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(2011) Use of recombinantly produced 15N3-labelled nicotianamine for fast and sensitive stable isotope dilution ultra-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 399: 1355-1361
Schmidt, H., Böttcher, C., Trampczynska, A., Clemens, S.
