Kristallisation und Röntgenstrukturanalyse von Prohormon/Proprotein Convertasen (PCs)
Final Report Abstract
Viele Proteine und Peptide müssen in Eukaryoten während der Sekretion erst durch eine spezielle Klasse von Serinproteasen, die Proprotein/Prohormon Convertasen (PCs), proteolytisch gespalten werden, um aktiv zu werden. Zu diesen PC-Substraten zählen Peptid-Hormone wie z.B. Insulin, extrazelluläre Proteasen, Wachstums- und Differenzierungsfaktoren, von denen vielen eine zentrale Rolle bei neurodegenerativen Krankheiten, der Entstehung von Krebs sowie bei der Metastase zugewiesen wird. Des Weiteren werden auch bakterielle Toxine und virale Hüllproteine erst durch spezifische PCs aktiviert. Entsprechend stellen die PCs als eine Art „zentraler Aktivitätsschalter“ ein hoch-interessantes Zielmolekül (Target) dar, welches auch die spezifische Entwicklung von Substanzen zur gleichzeitigen Beeinflussung mehrerer Prozesse (Pleiotropie) ermöglicht. Im Rahmen dieses Projektes wurde zunächst murines Furin, das am besten untersuchte und oft als PC-Prototyp bezeichnete Familienmitglied, kristallisiert und dessen 3D-Struktur in einer technisch sehr aufwendigen Prozedur proteinkristallographisch bestimmt. Des Weiteren wurde eine Elementspezifische Elektronendichtekarte entwickelt, die eine eindeutige Identifizierung der zwei spezifisch gebundenen Calcium-Ionen ermöglichte. Modellierungsstudien der anderen klassischen Familienmitglieder verbunden mit Homologieanalysen ermöglichten es, sowohl die Strukturen der homologen PCs PC1/3, PC2, PC4, PACE4, PC5/6, LPC/PC7/PC8 sowie die Struktur der inaktiven Proform des Furins und die zu dessen Reifung notwendigen strukturellen Veränderungen sehr genau vorherzusagen. Somit steht aus diesem Projekt jetzt ein detailliertes strukturelles Bild der klassischen PCs zur Verfügung, das es erlaubt die spezifische Erkennung von, sowie die aktivierende Proteolyse nach üblicherweise dibasischen Erkennungssequenzen im chemischen Detail zu verstehen. Eine Reihe von PC-spezifischen Sequenzbereichen in der Umgebung des aktiven Zentrums resultiert in der Ausbildung einer tiefen und negativ geladenen „active site cleft“. Furin, das nach der Konsensussequenz R-X-K/R-R-↓ (X steht für eine beliebige Aminosäure) schneidet, erkennt durch eine Reihe von Wasserstoffbrückenbindungen hierbei insbesondere an den P1- und P4-Positionen spezifisch die Arginin-Guanidinogruppen, während es an P2 vorwiegend die positive Ladung eines Arginin- oder Lysin-Restes erfasst. Weitere Strukturdaten ermöglichen ein ähnliches Verständnis der Struktur- Funktionsbeziehungen für die anderen Familienmitglieder. Dieses genaue strukturelle Verständnis der Substratbindung an die PCs ermöglichte es im nächsten Schritt eine ganze Reihe von Inhibitoren zu entwickeln, die Affinitäten für Furin bis in den picomolaren Bereich bei unterschiedlichen Spezifitätsprofilen innerhalb der PC-Familie zeigen, jedoch nicht an andere Proteasen wie z.B. FXa oder Trypsin binden. Momentan untersuchen wir zusammen mit unseren Kooperationspartnern deren biochemischen Eigenschaften sowie deren erwartete pharmakologische Eignung zur Behandlung einer Reihe von Krankheitsmodellen. Für eine rationale und Struktur-gestützte Weiterentwicklung der bereits etablierten sowie zur Auffindung neuer Inhibitoren ist eine experimentelle Aufklärung der entsprechenden Komplexstrukturen auch weiterhin erforderlich – Arbeiten, die von uns aktuell durchgeführt werden, die den Rahmen dieses Projektes jedoch übersteigen würden. Aufgrund der beobachteten Schwierigkeiten sowohl Komplexkristalle als auch Kristalle weiterer Mitglieder der PC-Familie zu erhalten, ist hierfür zunächst eine intensive Untersuchung und Verbesserung der verwendeten Expressions- und Reinigungsstrategien und möglicherweise auch die Etablierung neuartiger Expressionsstrategien erforderlich.
Publications
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