Project Details
Projekt
Elucidating the intracellular mechanisms of RNA interference by single molecule fluorescence microscopy and spectroscopy
Applicant
Professorin Dr. Petra Schwille
Subject Area
Biophysics
Term
from 2003 to 2011
Project identifier
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 5392510
Ziel dieses Projektes ist es, eine geeignete instrumentelle Plattform von neuen mikroskopischen und spektroskopischen Einzelmolekülmethoden zu schaffen, um in fundamentaler Weise zur Aufklärung des biochemischen Phänomens der zellulären RNA-Interferenz (RNAi) beizutragen. Unter RNA-Interferenz versteht man den erst kürzlich entdeckten posttranskriptionalen Regulationsmechanismus bei der Genexpression in verschiedenen Organismen. Die Anwesenheit kurzer doppelsträngiger RNA von 21-23 nt Länge (siRNA) bewirkt auf noch ungeklärte Weise, vermutlich durch Komplexierung mit verschiedenen zelleigenen Proteinen, den spezifischen Abbau der homologen mRNA und verhindert somit die Proteinproduktion. RNAi eignet sich für eine genomweite Analyse der Genfunktion in großem Maßstab und ist zeitsparender als herkömmliche Knock-out Technologien. Spektroskopische Einzelmolekülmethoden wie die von uns entwickelte FluoreszenzKreuzkorrelationsanalyse erlauben es in völlig neuartiger Weise, Dynamiken und molekulare Interaktionen verschiedener Moleküle und Molekülkomplexe in der lebenden Zelle zu verfolgen. Durch Kombination mit hochsensitiven bildgebenden Verfahren sollen diese Methoden eingesetzt werden, um die Bewegung der siRNAs durch die Zelle sowie ihre lokalen, spezifischen Interaktionen mit mRNA und Proteinen in Echtzeit zu untersuchen. Eine Aufklärung der einzelnen molekularen Schritte, die letztlich die Abschaltung der Genfunktion bewirken, kann im Idealfall zum Design besonders funktionaler siRNA-Assays führen, mit weitreichenden Konsequenzen für deren therapeutische Anwendung. Summary: Goal of this project is the establishment of an instrumental platform for novel microscopic and spectroscopic single molecule techniques to elucidate the molecular mechanisms of RNA interference. RNA interference is the process of post-transcriptional specific suppression of gene expression by short interfering RNA duplexes (siRNAs). Delivery of siRNAs to live mammalian cells has been shown to efficiently "knock-down" the expression of specific proteins, providing a fascinating new tool for studying gene function, but potentially also as gene-specific therapeutics. The molecular pathways of siRNAs from their delivery to specific interference of protein expression via mRNA degradation, supposedly by complexation with cellular proteins, are far from being understood. Single-molecule methods such as fluorescence cross-correlation spectroscopy previously developed by our group, are most powerful tools to study molecular interactions and dynamics in living cells. Their combination with ultrasensitive fluorescence imaging is thus a highly promising approach to follow not only the movement of siRNA once introduced to the cell, but also their specific local interactions with proteins and nucleic acids in real time. Identification of the individual steps in RNAi on a molecular level may eventually contribute to the development of improved siRNA duplexes, and may also provide insights into the selection of optimal target RNA structures or sequences.
DFG Programme
Priority Programmes
