Imaging assembly and turnover of the presynaptic cytomatrix

• Applicant: Professor Dr. Thomas Dresbach
• Co-Applicant: Professor Noam Ziv, Ph.D.
• Subject Area: Biophysics
• Term: from 2003 to 2012
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 5392028

Die Cytomatrix aktiver Zonen (CAZ) stellt ein molekulares Netzwerk dar, das an der Plasmamembran von Freisetzungsstellen für Neurotransmitter abgelegt wird. Die CAZ ermöglicht vermutlich zentrale Ereignisse wie Transport und Verankerung synaptischer Vesikel, Rekrutierung synaptischer Moleküle zur aktiven Zone und die Organisation der präsynaptischen Struktur. Bisher weiß man wenig über die Entstehung der CAZ, ihre Rolle bei der Synaptogenese sowie die Lebensdauer und die Dynamik von CAZ-Proteinen. Daher wollen wir die Dynamik von Genese und Funktion der CAZ mit speziellem Augenmerk auf das prototypische CAZ-Protein Bassoon analysieren. Um die Mechanismen der CAZ-Entstehung zu untersuchen, wollen wir fluoreszenzmarkierte Proteine paarweise in Neuronen exprimieren und Kinetik, Abfolge und gegebenenfalls Abhängigkeiten ihres Einbaus in entstehende aktive Zonen mit automatisierter Zeitraffer-Konfokal-Mikroskopie darstellen. Gleichzeitig wollen wir die Verweildauer einzelner Proteine in der existierenden CAZ untersuchen. In beiden Ansätzen fragen wir insbesondere, ob Proteine einzeln oder gemeinsam, z.B. verpackt auf den kürzlich identifizierten, sogenannten Vorläuferorganellen aktiver Zonen, ein- bzw. ausgebaut werden. Durch Epitop-Kartierung wollen wir die Anordnung von Bassoon in der CAZ auf der Ultrastrukturebene bestimmen. Diese Studie sollte zeigen, inwieweit die CAZ stabil oder dynamisch ist, welche dynamischen Ereignisse stattfinden und inwieweit Proteine wie Bassoon Entstehung und Funktion der CAZ organisieren. Summary: The cytomatrix at active zones (CAZ) is a molecular network deposited at sites of transmitter release. It is thought to organise the synaptic vesicle (SV) cycle and to recruit and anchor molecules for keeping the presynaptic membrane in register with the postsynapse. Little is known about assembly of the CAZ, its role in synaptogenesis, and its turnover and dynamics during normal synaptic function and synaptic plasticity. The major goal of this study is to investigate the dynamics of CAZ assembly and function with special focus on the prototypic CAZ protein Bassoon. Three complementary approaches will be used. (i) To examine mechanisms underlying CAZ formation, pairs of active zone molecules tagged with fluorescent proteins will be expressed and kinetics, temporal order and interdependence of their recruitment to new synapses will be assessed by automated time-lapse confocal microscopy. Initially, we will focus on molecules co-transported on recently discovered active zone precursor vesicles (AZPVs) and on SV proteins. (ii) Long-term live imaging studies of tagged proteins will be performed to characterise their turnover in the cytomatrix. In particular, we will ask whether these proteins are recruited to and removed from existing synapses individually or as distinct packages, i.e. AZPVs. (iii) The topological organisation of Bassoon in the CAZ will be studied by epitope-mapping. Our study should reveal to what extent the CAZ is stable or dynamic, what sorts of dynamic events take place and which role proteins like Bassoon play in controlling assembly and function of the CAZ.

• DFG Programme: Priority Programmes
• Subproject of: SPP 1128: Optical Analysis of the Structure and Dynamics of Supra Molecular Biological Complexes
• International Connection: Israel