NMR-spektroskopische Charakterisierung der elementaren Proteinfaltung und der Nukleinsäurebindung des Kälteschockproteins CspB
Final Report Abstract
Eine der Schlüsselstellen bei der Übertragung von genetischer Information in biologische Aktivität ist die präzise und effektive Faltung der Polypeptidkette. Zum Studium der elementaren Schritte der Proteinfaltung haben sich kleine Proteine bewährt, die nach einem einfachen 2-Zustandsmechanusmus falten. Zu diesen Proteinen zählt das Kälteschockprotein CspB aus Bacillus subtilis. Sowohl der Faltungsmechanismus wie auch die biologische Funktion (Bindung von einzelsträngigen Nukleinsäuren) standen im Mittelpunkt der Untersuchungen. Mittels neuer NMR-Methoden ist es gelungen, Proteinfaltungsraten im Minisekundenbereich zu messen wobei jede einzelne Aminosäure als NMR-Sonde aufgelöst werden konnte. Hieraus lässt sich ableiten, dass CspB während der Faltungsreaktion einen einzigen homogenen Übergangszustand passiert, der dem nativen Zustand bereits sehr ähnlich ist. Weiter erlaubt die Methode Untersuchungen zu Faltungskinetik ohne Zugabe von Denaturierungsmitteln, was mit anderen Methoden nicht möglich ist. Auch unter diesen fast physiologischen Bedingungen folgt CspB dem 2-ZustandsmodeU. Die für eine deslabilisierte Variante vorhergesagte Denaturierung bei niedrigen Temperaturen (-12 °C) konnte ebenfalls experimentell mittels NMR gezeigt werden. Die RNA-Chaperonwirkung von CspB bei niedrigen Temperaturen wird auf die Bindung an einzelsträngiger Nukleinsäuren zurückgeführt. Zwei Kristallstrukturen und eine NMR-Struktur von verschiedenen Nukleoproteinkomplexen zeigten, dass aromatische Reste an der Oberfläche von CspB durch Stapelwechselwirkung mit den Basen die Bindung vermitteln. Die bei der Kristallisation beobachtete Registerverschiebung der Bindungsstellen von CspB sowie das domain swapping bei thermophiiem Csp konnte in Lösung überraschenderweise nicht beobachtet werden. Kinetische Fluoreszenz-Messungen ergaben, dass CspB zunächst die Nukleinsäure nach einer geeigneten Bindungsstelle abrastert, bevor nach einem inducedfit Mechanismus die hoch affine Bindung erfolgt. Hierbei verliert CspB einen Großteil seiner Dynamik, was zu einer starken Änderung der Entropie des Systems führt. Die temperaturabhängige Kompensation der Bindungsenthalpie durch diese Entropieänderung erklärt, warum nur bei einem Kälteschock CspB stark an Nukleinsäuren bindet. Überraschenderweise konnte die in vivo RNA-Chaperonwirkung von CspB bei der zellfreien Proteinsynthese nicht nachgestellt werden. Aus dem Projekt sind bislang 10 Publikationen hervorgegangen sowie zwei Promotionen und eine Diplomarbeit.
Publications
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