Simulation funktioneller Prozesse von Proteinen
Final Report Abstract
Das Ras-Enzym ist u.a. der zentrale Schalter einer Signaltransduktionskaskade in eukaryotischen Zellen, die zur Zellteilung führt. Als Protoonkogen ist Ras mögliches Target für Wirkstoffe, so dass Struktur, Konformationsübergänge und Katalyse von zentraler Bedeutung sind. In der Zelle liegt Ras zunächst in einem deaktivierten, stabilen Zustand vor. Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren (GEF) aktivierten Ras durch Austausch des gebundenen Substrats Guanosindiphosphat (GDP) zu Guanosin triphosphat (GTP). In der aktiven Form wechselwirken u. a. Raf-Kinasen mit Ras und leiten das externe Wachstumssignal in den Zellkern weiter. Ras wird innerhalb von rund 30 Minuten deaktiviert durch Hydrolyse von GTP, d. h. Abspalten einer endständigen Phosphatgruppe des Triphosphats. Die Hydrolyse ist 10^5 mal schneller als ohne Ras. GTPase-aktivierende Proteine (GAP) regulieren die Signaltransduktion. Sie binden an aktivem Ras und beschleunigen die Hydrolyse um einen weiteren Faktor 10^5 auf etwa 50 ms. Wesentliche Ursache ist der Argininfinger R789GAP, der in die Bindenische des Ras-Proteins eingeführt wird. Nach der Hypothese von Wittighofer hat Arginin einerseits durch Koordinierung des nukleophil angreifenden Wassers, anderseits durch seine positive Ladung eine katalytische Wirkung auf den Bindungsbruch. In diesem Projekt wurde durch Computersimulation der präkatalytische Zustand des GTP untersucht, der sich durch Bindung in Ras und im Ras-GAP Komplex herausbildet, und mit den Ergebnissen von GTP in Wasser verglichen. Unsere QM/MM-Simulationen zeigen für das GTP im Ras-RasGAP-Komplex, verglichen mit dem Ras allein, eine Zunahme der Elektronenverschiebung, Verlängerung der Bindung und Verdrillung hin zu einer starren, ekliptischen Konformation. Der präkatalytische Zustand ist dem Produktzustand ähnlicher und kann mit einer höheren Rate reagieren. Überraschend war das Ergebnis der Ursache für diese Befunde. Erst durch Analyse aller Beiträge zum elektrostatischen Feld im Substrat konnte gezeigt werden, dass die positive Ladung des Argininfingers R789GAP nicht katalytisch wirkt, sondem sogar kontraproduktiv ist. Der entscheidende Effekt ist die Feldverstärkung durch Verdrängung aller nicht beteiligten Wassermoleküle in der Bindenische. Sie werden im RasRasGAP-Komplex durch den Argininfinger verdrängt, der durch die positive Ladung verankert ist. In Ras allein schwächen die Wasser das Feld. Dies erklärt qualitativ die beobachtete positive Reaktionsentropie. Weiter wurde gezeigt, dass eine hypothetische Protonierung des Beta-Phosphats unmittelbar zu einem Bruch der Bindung zwischen Beat- und Gamma-Phosphat mit Bildung eines planaren Metaphosphats führt. Zur Kontrolle wurden stets, wie schon für Ras, die IR-Phosphatbanden von GTP sowie dem Folgeintermediat GDP-Pi in Ras-RasGAP berechnet. Sie weisen gute Übereinstimmung mit den experimentellen IR-Spektren auf.
Publications
- 2007. Role of the arginine finger in Ras.RasGAP revealed by QM/MM calculations. FEBS Lett 581, 5677-84
te Heesen, H., Gerwert, K., and Schlitter, J.
- Untersuchung der GAP-katalysierten GTP-Hydrolyse mit Dichtefunktionalthcorie und MD-Simulationen. Dissertation, Ruhr-Universität Bochum, Germany, Bochum 2007, pp. 5677-84
te Heesen, H.
