Charakterisierung der Bedeutung PDGF-vermittelter Signaltransduktionswege für die Hypertrophie und Funktion von Kardiomyozyten
Final Report Abstract
Im Rahmen des beantragten Projekts sollte mit Hilfe selektiv aktivierbarer chimärer ßPDGFR-Mutanten in Herzmuskelzellkulturen die Rolle einzelner rezeptorassoziierter Signalmoleküle des ßPDGFR (Src. PI3K, RasGAP. SHP-2, PLCy) für die PDGF-vermittelte Hypertrophie von Herzmuskelzellen untersucht werden. Durch Integration der Rezeptor-Mutanten in ein in vitro Herzmuskelmodell (Engineered Heart Tissue, EHT) sollten zudem die Auswirkungen PDGF-vermittelter Effekte auf die kontraktile Funktion untersucht und relevante Signaltransduktionswege charakterisiert werden. Im Rahmen der Durchführung des Projekts ergaben sich in der frühen Phase 2 wesentliche Probleme: (i) Die dem Projekt u.a. zugrunde liegende (auf mehreren Publikationen anderer Arbeitsgruppen basierte) Hypothese, dass PDGF-BB an Herzmuskelzellen eine Hypertrophie induziert, ließ sich in unseren Händen nicht reproduzieren; (ii) Die ChiR-Mutanten ließen sich mit Hilfe des geplanten adenoviralen Systems aufgrund technischer Probleme nicht wie geplant in Herzmuskelzellen exprimieren. Aufgrund dieser erheblichen Probleme wurde das Projekt folgendermaßen modifiziert: A. Während PDGF-BB an Herzmuskelzellen keine Hypertrophie induzierte, zeigten die Untersuchungen an EHTs nicht wie angenommen eine Verminderung, sondern eine Verbesserung der Kontraktionskraft durch PDGF-BB. Wir konnten den zugrunde liegenden Mechanismus identifizieren. PDGF-BB verbesserte sowohl an isolierten Herzmuskelzellen als auch in EHTs PI3-Kinase-abhängig das Überleben von Kardiomyozyten und führte zu einer effizienteren Bildung von EHTs sowie zu einer gesteigerten kontraktilen Funktion. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Entwicklungsbedingungen von EHTs als therapeutischer Ansatz durch eine Simulation nativer Umgebungsbedingungen unter Berücksichtigung einzelner Wachstumsfaktoren optimiert werden kann. Diese Erkenntnisse sind möglicherweise sowohl für den Erhalt von Myokardgewebe bei akuten Myokardinfarkten als auch für eine gesteigerte Effizienz bei zellregenerativen Therapieansätzen von Bedeutung. B. Im Unterschied zu PDGF zeigte sich ein hypertropher und fibrotischer Effekt am Myokard durch TGF-ß. In einem TGF-ß-transgenen Mausmodell untersuchten wir den kardialen Phänotyp und Energiemetabolismus sowie das „Networking" mit neurohumoralen Systemen wie dem Renin-Angiotensin-System und dem ß-adrenergen System. Die Herzen TGFß-transgener Mäuse wiesen eine deutliche Hypertrophie sowie eine gesteigerte hypertrophe Ansprechbarkeit auf ß-adrenerge Stimuli auf. während die kontraktile Antwort auf ß-adrenerge Stimuli signifikant herabgesetzt war. Beide Effekte wurden durch eine chronische ß-Blocker-Therapie, nicht jedoch durch eine ATi-Rezeptor-Blockade, aufgehoben. Ursache für die verminderte kontraktile Reserve war eine Dysregulation des mitochondrialen Energiemetabolismus durch Heraufregulation von Uncoupling-Proteinen (UCPs). Dies wurde durch eine chronische ß-Blockade verhindert. ß-Blocker könnten ihre benefiziellen Effekte bei Herzinsuffizienz über diesen Mechanismus vermitteln. C. Da die Überexpression der PDGF C-Isoform, die zu einer Aktivierung des PDGF a-Rezeptor-Subtyps führt, zu einer ausgeprägten Myokardhypertrophie und Ausbildung einer Herzinsuffizienz führt, wurden die Signalmechanismen des alpha-PDGFR mittels Rezeptor-Mutanten in Fibroblasten systematisch untersucht. Wir fokussierten auf die Mechanismen der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und die Regulation der Apoptose. Die aPDGFR-induzierte ROS-Bildung in Fibroblasten wird selektiv durch PI 3-Kinase, und im Speziellen durch die katalytische 110alpha-lsoform, vermittelt, die die Translokation der zytosolischen NAD(P)H-Oxidase-Untereinheiten p47phox und Rac-1 an die Zellmembran und somit in der Bildung des aktiven NAD(P)H-Oxidase-Komplexes induziert. Der aPDGFR-vermittelte Schutz vor Apoptose wird ebenfalls durch PI 3-Kinase vermittelt, während Src-Kinasen diesen Mechanismus negativ regulieren. Zusammenfassend wurde PI 3-Kinase als zentrales Signalmolekül alpha-PDGFR-vermittelter Zellreaktionen in Fibroblasten identifiziert. D. Während die Expression der ChiR-Mutanten in Herzmuskelzellen nicht gelang, wurden diese in VSMCs erfolgreich exprimiert. Mit Hilfe dieses Systems wurden nun zunächst die Mechanismen des ßPDGFR-vermittelten Schutzes vor Apoptose in VSMCs systematisch untersucht. Im Gegensatz zu vorhergehenden Untersuchungen zeigte sich, dass für den anti-apoptotischen Effekt von PDGF-BB ausschließlich PI3- Kinase von Bedeutung ist, während alle anderen Signalmoleküle keine Rolle spielen. Jedoch zeigte sich, dass der antiapoptotische Effekt nur transient ist. und dass eine chronische Stimulation mit PDGF-BB in VSMCs ebenfalls PI3K-abhängig zur Induktion der Apoptose führt. Dieser Effekt ließ sich auch in einem in vivo-Modell zeigen. Während die Apoptoserate in atherosklerotischen Plaques LDLR/LRP1- defizienter Mäuse durch eine vermehrte Expression von PDGFR gesteigert war, ließ sich dieser Effekt durch Mutation der PI3-Kinase-Bindungsstelle in PDGFR F2/F2- Mäusen wieder aufheben. Chronische PDGF-Stimulation kann in atherosklerotischen Plaques durch eine PI3K-abhängige Induktion von Apoptose zur Instabilität nPlaques führen. Weitere Untersuchungen fokussierten auf die Identifizierung derjenigen PDGF-induzierten Signalwege, die für Atherosklerose-relevante zelluläre Reaktionen (Migration, Proliferation) verantwortlich sind. P13K und PLCgamma konnten als relevante Signalmoleküle für den mitogenen Effekt identifiziert werden, während Src, PI3K und PLCy für das chemotaktische Signal des ßPDGFR bedeutsam sind. Auf der Basis der in vivo-Untersuchungen wurde durch Mutation der PI3K- und PLCy- Bindungsstellen des ßPDGFR in vivo (PDGFR F3/F3-Maus) die Neointima-Bildung untersucht, die in PDGFR F3/F3-Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen deutlich vermindert war. Somit spielt die Aktivierung des ßPDGFR eine entscheidende Rolle bei der Neointima-Bildung, und die selektive Beeinflussung einzelner Signalwege bietet eine Möglichkeit der therapeutischen Intervention.
