Struktur-Funktions-Beziehung von Cnx1 und Gephyrin bei der Bildung von Proteinclustern in pflanzlichen und tierischen Zellen
Final Report Abstract
Im Labor des Co-Antragstellers wurde der Molybdäncofaktor(Moco)-Biosyntheseweg bei Arabidopsis und beim Menschen in den Grundzügen aufgeklärt. Der letzte Schritt der Moco-Biosynthese wird durch das pflanzliche Protein Cnx1 bzw. das tierische Gephyrin katalysiert. Beides sind multifunktionale Proteine, die durch Domänenfusionen individuelle Teilreaktionen der Moco-Biosynthese vereinen. Während Gephyrin eine zweite Funktion in der Bindung und Clusterung von inhibitorischen Neurorezeptoren übernimmt, wurde für Cnx1 postuliert, daß es an der Bildung zellulärer Proteincluster beteiligt sein könnte und mit weiteren Liganden interagiert. Deshalb wurden drei Ziele im Antrag formuliert: 1. Identifizierung und Charakterisierung von Cnx1-Liganden. Nach unserem Arbeitsmodell postulieren wir die Bildung eines Enzymkomplexes verschiedener Proteine des Moco-Syntheseweges, um eine effiziente Weitergabe der instabilen Vorstufen und Intermediate zu erreichen ("product-substrate-channeling"). Wir konnten zeigen, dass in der lebenden Zelle Cnx1 nicht nur mit der Molybdopterin- Synthase interagiert, sondern auch mit dem nachfolgenden Moco-Bindeprotein MoBP. MoBP gehört einer neuen Genfamilie an, deren acht Mitglieder wir hier charakterisiert haben und die offensichtlich an der Verteilung des Moco beteiligt sind. Cnx1 ist damit zentraler Teil des zellulären Netzwerkes von Moco- Biosynthese und -Weitergabe. Wir haben jedoch vorerst keine Hinwesie darauf, daß Cnx1 (analog zum tierischen Gephyrin) als Ankerprotein für Transmembranproteine dient. 2. Analyse spleiss-spezifischer Funktionen von Gephyrin. Es sollte geklärt werden, in wie weit alternatives Spleissen zur Funktionsdiversifizierung von Gephyrin beiträgt. Wir haben acht verschiedene Spleissvarianten hinsichtlich ihrer Aktivität in der Moco-Biosynthese untersucht und konnten zeigen, dass nur Spleissvarianten mit Modifikationen in der konservierten G- und E-Domäne keine Moco-Synthese zeigen. Spleissvarianten mit verschiedenen Kassetten in der zentralen Domänen (C-Domäne) sind katalytisch aktiv, sind aber in Neuronen nicht an der Moco Synthese beteiligt, da dieser von einer Gephyrin-Variante mit der leberspezifischen C3-Kassette in Glia gebildet wird. Alle Spleissvarianten waren in der Lage den Glycin-Rezeptor zu binden. 3. Struktur-Funktionsbeziehung von Cnx1 und Gephyrin. Das langfristig formulierte Ziel, die Struktur beider Proteine aufzuklären, ist noch offen. Es war jedoch möglich wichtige Meilensteine auf diesen Weg zu erreichen. So konnte die Kristallstruktur der Gephyrin E-Domäne mit und ohne gebundenem Glyzinrezeptor-Peptid (in Kooperation) aufgeklärt werden. Struktur-basierte Mutagenese identifizierte eine Oberflächen-Loop in der E-Domäne, der für die Clusterung/Aggregation von Gephyrin verantwortlich ist. Zelluläre Experimente haben zudem aufgedeckt, dass Gephyrin über einen neuartigen Mechanismus, der unabhängig von der E-Domänen-Dimerisierung scheint, oligmerisiert. Einzelmolekül-EM erlaubte erste Einblicke in die dreidimenionale Sturktur von Gephyrin. Durch die Arbeiten der Antragsteller wurde der Molybdäncofaktor(Moco)- Biosyntheseweg bei Arabidopsis und beim Menschen in den Grundzügen aufgeklärt.
Publications
-
2006. Deciphering the structural framework of glycine receptor anchoring by gephyrin. EMBO J 25: 1385-1395
Kim, E. Y., Schrader, N., Smolinsky, B., Bedet, C., Vannier, C., Schwarz, G., and Schindelin, H.
-
Molybdenum Cofactor Biosynthesis and Molybdenum Enyzmes. Ann. Rev. Plant Biol. (2006), 57, 623-47
Schwarz, G. and R.R. Mendel
-
2007. Vertebrate-specific sequences in the gephyrin E-domain regulate cytosolic aggregation and postsynaptic clustering. J Cell Sci. 120:1371-82
Lardi-Studler B, Smolinsky B, Petitjean CM, Koenig F, Sidler C, Meier JC, Fritschy JM, Schwarz G
-
2008. Gephyrin: Where do we stand, where do we go? Trends in Neuroscience 31: 257-64
Fritschy, J.-M., Harvey, R., Schwarz, G.
-
2008. Splice-specific functions of gephyrin in molybdenum cofactor biosynthesis. J Biol Chem 283: 17370-9
Smolinsky B, Meier JC, Buchmeier S, Schwarz G
-
(2009) Molybdenum cofactors, enzymes and pathways. Nature 460, 839-847
Schwarz G., Mendel R.R. & Ribbe M.W.
-
Identification and biochemical characterization of molybdenum cofactor-binding proteins from Arabidopsis thaliana (2010). J. Biol. Chem.
Kruse, T., Gehl, C., Geisler, M., Lehrke, M., Ringel, P., Hallier, S., Hänsch R., and Mendel, R.R.
