DNA-dependent cofactor selectivity of the glucocorticoid receptor

• Applicant: Professor Dr. Thorsten Heinzel
• Subject Area: Cell Biology
• Term: from 2002 to 2013
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 5363282

Der Glucocorticoidrezeptor (GR) steuert physiologische Prozesse durch Aktivierung bzw. Repression spezifischer Zielgene. Während die Transaktivierung detailliert charakterisiert wurde, ist noch unklar welche molekularen Mechanismen der Repression zugrunde liegen. Bei negativ regulierten Zielgenen wird die Repression nicht durch klassische GR DNA-Elemente (GRE), sondern durch negative GRE (nGRE), Komposit-GRE oder Transrepression vermittelt. Auf den nGRE induzieren vermutlich allosterische Effekte der DNA eine Rezeptorkonformation, die die Bindung von Corepressoren anstelle von Coaktivatoren begünstigt. GR Komplexe mit nGRE und klassischen GRE werden als Affinitätsmatrix zur Anreicherung von Kofaktoren dienen. Viele bekannte Coaktivatoren und Corepressoren können mit vorhandenen Antikörpern detektiert werden. Die Bindung neuartiger Kofaktoren wird entweder mit der "Far Western" Methode nachgewiesen wird oder durch Färbung von Proteinbanden (Silber oder Coomassie) nachgewiesen. Zur Identifizierung dieser Proteine soll bevorzugt MALDI-TOF Massenspektroskopie eingesetzt werden. Die weitere Analyse wird sich auf Proteine konzentrieren, die differentiell an unterschiedliche GR-DNA-Komplexe binden. Zur funktionellen Charakterisierung reprimierender Kofaktoren sollen stabile nGRE-Reporterzellinien mit dominant-negativen Expressionskonstrukten transfiziert werden. Die Behandlung dieser Zellinien mit HDAC-Inhibitoren wird zeigen, ob die Rekrutierung von Histondeacetylasen zur Repression beiträgt. Mit konformationsspezifischen Peptiden sollen schließlich die strukturellen Voraussetzungen der Rekrutierung von Kofaktoren auf den verschiedenen GRE analysiert werden.

• DFG Programme: Research Grants