Die Rolle der phosphatbindenden Tasche von Cyclin B1 bei der zeitlich geordneten Substratphosphorylierung

• Antragsteller: Professor Dr. Thomas Mayer
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 532411725

Die fehlerfreie Durchführung und zeitlich korrekte Abfolge der verschiedenen Zellzyklusphasen stellen wichtige Garanten für die Lebensfähigkeit eines jeden Organismus dar. Taktgeber für den Eintritt in und Austritt aus den unterschiedlichen Zellzyklusphasen sind Cyclin-abhängige Kinasen (Cdks) im Komplex mit einer aktivierenden Cyclin Untereinheit. Während die zentrale Rolle von Cdks für die Zellzyklusregulation bekannt ist, wissen wir nur wenig darüber, wie die Vielzahl an Cdk/Cyclin Substraten in der richtigen Reihenfolge phosphoryliert werden und somit die korrekte Abfolge der diversen Zellzyklusprozesse garantiert wird. Kürzlich wurde eine Phosphatbindetasche in Cyclin B1 identifiziert, welche innerhalb der B-Typ – aber nicht A-Typ Cycline – hoch konserviert ist. Über diese positiv geladene Tasche bindet Cyclin B1 an einen phosphorylierten Serinrest der Separase, einem Regulator von Cdk1/Cyclin B1. Basierend auf diesen Daten postulieren wir, dass die Phosphatbindetasche von Cyclin B1 nicht nur für die Interaktion mit dem Regulator Separase, sondern auch für die Bindung von Substraten wichtig ist. Demnach würden bereits phosphorylierte Substrate an die Phosphatbindetasche von Cyclin B1 binden, um anschließend an weiteren Positionen durch Cdk1/Cyclin B1 phosphoryliert zu werden. Ein solcher Mechanismus könnte maßgeblich zur Substratspezifität und zeitlich korrekten Abfolge von Substratphosphorylierungen beitragen. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese konnten wir bereits zeigen, dass Zellen mit einer mutierten Phosphatbindetasche in Cyclin B1 mitotische Defekte aufweisen. Mit Hilfe von in vitro Assays konnten wir ausschließen, dass die eingeführten Mutationen die Kinaseaktivität von Cdk1/Cyclin B1 unspezifisch beeinflussen. Massenspektrometrische (MS) Analysen identifizierten Untereinheiten der Ubiquitinligase APC/C, mitotische Checkpoint-Proteine und Kinesine als Proteine, welche mit Wildtyp Cyclin B1, jedoch nicht mit mutiertem Cyclin B1 interagieren. Im Rahmen dieses Projekts werden wir in diesen Proteinen sowohl die Phosphorylierungsstellen identifizieren, welche an die Phosphatbindetasche von Cyclin B1 binden, als auch die Phosphorylierungsstellen, die im Anschluss durch Cdk1/Cyclin B1 phosphoryliert werden. Dazu werden wir umfangreiche MS-basierte Phosphoprotein Analysen durchführen. Um zu untersuchen, wie diese sequenziellen Phosphorylierungsereignisse die Funktion der jeweiligen Substrate beeinflussen, planen wir umfassende Studien in Zellen sowie in Eizellextrakt und in vitro. Diese Untersuchungen werden grundlegende Erkenntnisse darüber liefern, wie die Phosphatbindetasche in Cyclin B1 sowohl zur Spezifität als auch zur zeitlich korrekten Phosphorylierungsabfolge der zahlreichen Cdk1/Cyclin B1 Substrate beiträgt; zwei Grundvoraussetzungen für ein fehlerfreies Durchlaufen des Zellzyklus.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen