Project Details
Projekt
Kombinatorische Selektion von Anticalinen an immobilisierten Peptidkollektiven
Applicant
Professor Arne Skerra, Ph.D.
Subject Area
Biochemistry
Term
from 2001 to 2005
Project identifier
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 5464458
Anticaline sind eine neuartige Klasse ligandenbindender Proteine mit molekularen Erkennungseigenschaften ähnlich den Antikörpern. Diese künstlichen Proteine wurden durch evolutives Protein Design ausgehend von Lipocalinen gewonnen. In einem kombinatorischen Ansatz wurde das Bilin-Bindungsprotein (BBP) aus P. brassicae erstmals verwendet, um Lipocalinvarianten zu konstruieren, die neue Liganden erkennen. Insgesamt 16 Aminosäuren in den vier Peptidschleifen, die die Bindungstasche bilden, wurden dazu einer gerichteten Zufallsmutagenese unterworfen. Aus der gewonnenen Bibliothek von 3,7x10 8 Mutanten wurden mittels der Phage Display-Technik künstliche Bindungsproteine vor allem für haptenartige Liganden, wie Fluorescein und Digoxigenin, selektiert. Ausgehend von diesen Resultaten soll die Anticalin-Technologie nun eingesetzt werden, um in parallelisierter Weise eine Vielzahl spezifischer Bindungsproteine gegen Peptidsequenzen, die an einem polymeren Trägermaterial ortsgebunden vorgegeben sind, zu erzeugen. Die Target-Peptidsequenzen sollen letztlich von 8000 N-terminalen Hexapeptidsequenzen humaner cytosolischer Proteine abgeleitet werden. Dieses (bzw. zu Testzwecken ein kleineres) Kollektiv soll mit einer geeignet randomisierten Bibliothek der Anticaline inkubiert werden. Nach Gleichgewichtseinstellung sollen die Phagemide von jedem Peptid-Spot eluiert und deren Gensequenz sowie die funktionellen Eigenschaften der kodierten Anticaline analysiert werden. Unter den zu optimierenden Selektionsbedingungen sollte ein Konkurrenzeffekt zwischen den diversen Peptidsequenzen einerseits und den zufällig generierten Bindungsstellen der Anticaline andererseits eintreten, so daß an jedem Spot im Idealfall nur ein oder zumindest wenige Vertreter der Anticalin-Population gebunden werden. Die sonst bei der Phage Display-Methode üblichen repetitiven Anreicherungszyklen könnten sich auf diese Weise erübrigen. Die aus diesem Projekt resultierenden Antipeptid-Anticaline dürften nicht nur als diagnostische Reagenzien im Rahmen der Proteomanalytik oder der medizinischen Gewebetypisierung von Nutzen sein. Darüber hinaus bieten sich vielfältige wissenschaftliche Anwendungen im biochemischen Studium von Proteinen, deren biomolekularen Interaktionen sowie der Zellbiologie an.
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