Funktionelle Wechselwirkungen des Signalerkennungspartikels aus E. coli

• Applicant: Professor Dr. Wolfgang Wintermeyer
• Subject Area: Cell Biology
• Term: from 2001 to 2005
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 5314622

Ein Teil der von Bakterien exportierten oder in die innere Zellmembran eingelagerten Proteinen wird während der Synthese am Ribosom in Kontakt mit der Zielmembran gebracht und cotranslational transloziert. Die N-terminale Signalsequenz dieser Proteine wird am Ribosom vom Signalerkennungspartikel (SRP), bestehend aus 4.5S RNA und dem Ffh-Protein, gebunden; der Membrankontakt wird über die Bindung zwischen SRP und SRP-Rezeptor, FtsY, vermittelt. Ziel des Vorhabens ist es, die Wechselwirkungen zwischen SRP, Ribosomen und SRP-Rezeptor sowie funktionell wichtige Konformationsänderungen der Komplexpartner zu charakterisieren. Folgende Fragestellungen sollen bearbeitet werden: 1. Lokalisierung der SRP-Bindungsstelle am Ribosom; 2. Domäneninteraktionen im SRP-FtsY-Komplex; 3. Funktionelle Konformationsänderungen von Ffh. Wesentliche Methoden sind die UV-induzierte Vernetzung von SRP mit Ribosomen und SRP-Rezeptor, die chemische Modifizierung ribosomaler RNA, sowie Fluoreszenzmessungen an spezifisch markiertem SRP und SRP-Rezeptor. Zur Kopplung UV-aktivierbarer, reaktiver Gruppen (Azidophenacylbromid) oder Fluorophore werden 5´-Phosphorothioatgruppen in 4.5S RNA-Derivate bzw. Cysteinreste in Oberflächenpositionen der Proteine Ffh und FtsY eingebaut. Die Tertiärstrukturen der zu markierenden NG-Domänen beider Proteine sind bekannt. Kinetische Messungen zur Strukturdynamik des Ffh bei der SRP-Bildung und bei der SRP-Bindung an das Ribosom sollen anhand des Fluoreszenzresonanzenergietransfers zwischen zwei, in verschiedenen Domänen von Ffh positionierten Fluorophoren durchgeführt werden. Geeignete Markierungspositionen werden auf der Basis eines von uns entwickelten Modells der Anordnung der NG- und M-Domänen in der Tertiärstruktur von Ffh ausgewählt. Die Struktur von Ribosomenkomplexen mit SRP bzw. mit SRP und FtsY soll auch mit Hilfe der Cryoelektronenmikroskopie untersucht werden.

• DFG Programme: Research Grants