Der Sortierapparat in polaren Zellen
Final Report Abstract
Polar aufgebaute epittieliale und neuronale Zellen verfügen über einen hoch spezifischen Sortierapparat, der sekretorische und membranständige Proteine zu den verschiedenen Domänen der Plasmamembran hin dirigiert. Mit molekularbiologischen und biochemischen Untersuchungen sollten die protein- und zelltypspezifischen Unterschiede in der Effizienz der Sortierung und in der Absättigung des gesamten Sortierapparates aufgeklärt werden. Chemische Chaperone wie Curcumin, die bereits bei Erkrankungen wie der Huntingtonschen Krankheit und der Cystischen Fibrose die vorliegende Fehlfaltung korrigieren, wurden von uns bei der Saccharase-lsomaltase-fSh-Mutante Sl-QR eingesetzt. Hier jedoch konnte die native Konformation und somit das Erreichen der apikalen Plasmamembran nicht wiederfiergestellt werden. Bei einem anderen apikal sortierten Enzym, der intestinalen Laktase-Phlorizin-Hvdrolase (LPH), wurde mittels loop-out-PCR jede einzelne der vier homologen, extrazellulär lokalisierten Domänen deletiert. Dabei war das Ziel, ihre Bedeutung beim trafficking, beim intrazellulären Transport und für die Ausprägung der strukturellen und funktionellen Merkmale, weiter zu untersuchen. Es konnte gezeigt wenden, dass das Fehlen der homologen Domäne IV - ein Bestandteil der reifen Bürstensaummembranfomi LPHß, welcher die Laktase-Aktivität trägt - eine Beschleunigung der Transportrate und die Lokalisation der Deletionsmutante an der Zelloberfläche zur Folge hat. Zudem war die Faltung dieser Proteinform korrekt, die verbleibende enzymatische Aktivität (Phlorizin-Hydrolase) des Proteins hingegen vermindert, was auf eine bedeutende Rolle dieser Region in der gesamten LPH hinweist. Außerdem erlangt die Mutante ihre quaternäre Struktur erst im Golgi-Apparat und nicht wie die LPH im Endoplasmatischen Retikulum (ER), wobei die mutante Proteinform Oligomere bildet und nicht wie das Wildtyp-Pratein Dimere. Des weiteren zeigt diese Mutante ein anderes Verthalten bei der Assoziation mit bestimmten Membranmikrodomänen als das Wildtyp-Protein; die Mutante ist schwächer mit Tween-20-raffs assoziiert, was charakteristisch für basolateral sortierte Proteine ist. Dieses Ergebnis geht konform mit der Beobachtung, dass die Mutante in polaren MDCK-Zellen nicht in vergleichbarer Weise effizient zur apikalen Membran sortiert wird wie das Wildtyp-Protein. Zusätzlich zeigt sich in COS-1-Zellen nur eine partielle Kolokalisierung in identischen Transportvesikeln, mit einer heterogenen Proteinverteilung von Wildtyp-Protein und Mutante, wie sie bei der Sl und der LPH beobachtet wurde. Aufgrund der evidenten Bedeutung der homologen Domäne III für das Gesamtprotein wurde ein Konstrukt generiert, welches aus einer Signalsequenz zur Translokation ins ER und der Domäne III besteht. Dieses lösliche Protein zeigt sich transportkompetent, zusätzlich konnte mit Zellkultureinsätzen zur Separation des basolateralen vom apikalen Bereich eine effiziente Sortierung ins apikale Medium nachgewiesen werden, was auf das Vorhandensein von mindestens einem Sortiersignal in dieser Region hindeutet Außerdem weist die Tatsache, dass sich bei dem Konstrukt - wie beim Wildtyp-Protein - die Phlorizin-Hydrolase-Aktivtät detektieren lässt, darauf hin, dass es sich bei der Domäne III um eine autonome Domäne handelt. Des weiteren wurde für das Zell-Adhäsionsmolekül Protxadherin LKC (PLKC) die Expression in epithelialen Zellen, die intrazelluläre Lokalisation sowie das Transportvertialten und funktionelle Eigenschaften untersucht. Es wurde für alle bearbeiteten Zelltypen eine signifikante Steigerung der mRNA-Konzentration im zeitlichen Verlauf der Ausdifferenzierung der Zellen nachgewiesen. Dies korreliert mit einer Umverteilung des Proteins zur apikalen Membran und in die Regionen der Zell-Zell-Interaktion an der lateralen Membran. In voll ausdifferenzierten Monolayem von Nierenepithelzellen (MDCK II), die stabil mit PLKC-YFP (yellow fluorescent protein] transfiziert wunden, wurde das Protein hauptsächlich an der apikalen sowie an der lateralen Membran gefunden. Die Quantifizierung der Proteinverteilung über eine Oberflächenbiofinylierung ergab eine über 95%ige Sortiergenauigkeit zur apikalen Membran. Um Aufschluss über strukturelle Charakteristika des Proteins zu gewinnen, wurden verschiedene Deletionsmutanten erstellt und somit die Rolle der einzelnen extrazellulären Domänen, der Transmembran-Domäne sowie einer intrazellulären PDZ-Bindungssequenz bzw. der gesamten zytosolischen Domäne untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass durch die Deletion der Transmembran-Domäne zwar die Assoziation mit rafts aufgehoben wird und eine sekretorische Variante kreiert wird, aber eine eindeutig apikale Sortierung beibehalten wird. Das Prostata-spezifische Membranantigen (PSMA) ist ein integrales apikales Glykoprotein, das in Prostatakarzinomen überexprimiert ist. Die Konversion der mannose-reichen zur komplex-glykosylierten PSMA-Form erfolgt nur langsam, wobei wir zwei unterschiedliche mannose-reiche Glykofonnen beobachten konnten. Interessantenweise eriangt PSMA seine korrekte Faltung offenbar erst nach Verlassen des ER. Zudem konnte im Zuge der Reifung und des Transportes an die Zelloberfläche ein Wechsel von Tween-20-unlöslichen (ER) zu Lubrol-WX-unlöslichen rafts (Golgi, Plasmamembran) beobachtet wenden. Die Zelloberflächenexpression von PSMA ist des weiteren genauso wenig wie seine effiziente apikale Sortierung durch Inhibitoren der N- und 0-Glykosyliemng beeinflusst. Als weitere Proteine untersuchten wir bei natürlich auftretenden Mutationen der humanen Aminopepfidase N (APN) die intrazelluläre Verteilung, das Expressionsmuster und die enzymatische Aktivität sowie bei Phospholipase D (PLD), einem Rezeptor-regulierten Signalenzym, das Fettsäurenmuster von zellulären Membranen, die Aktivitäten und zelluläre Verteilung. Bei letzterer wirkte sich die Zugabe von Linol- und Linolensäure dramatisch auf die zelluläre Verteilung hin zur Plasmamembran aus.
Publications
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