Conditional complementation of essential human cytomegalovirus gene deletion mutants by Tn7 transposon insertion

• Applicant: Dr. Gabriele Ruth Hahn
• Subject Area: Virology
• Term: from 2000 to 2004
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 5278404

CMV-Reaktivierung nach Transplantationen und bei Immunsuppression stellt ein immer noch schwer zu kontrollierendes klinisches Problem dar. CMV Vakzinierung war bisher wenig erfolgreich, da kein Schutz vor Infektion oder Reaktivierung erzielt werden konnte, sondern nur der Krankheitsverlauf mitigiert wurde. Ein Ansatzpunkt zur Lösung dieses Probelems wäre es, ein besseres Verständnis der frühen Replikationsmechanismen von CMV zu erwerben, um letztendlich gezielt die Replikation und Reaktivierung steuern oder verhindern zu können.Eines der Hauptregulatiorproteine von CMV ist das IE2 (immediate early 2) Protein, das einen Schlüsselmechanismus im Replikationszyklus innehat. Bisher ist es aufgrund der Toxizität des IE2-Proteins in Zellkultur nicht möglich gewesen, ein ie2-Knockout-Virus herzustellen. Da es uns vor kurzem gelungen ist, HCMV als Bacmid in E.coli zu klonieren (5,20), sind wir in der Lage, essentielle Gene von HCMV in E.coli zu mutagenisieren. Im beantragten Projekt ist vorgesehen, eine ie2-Deletionsmutante durch Mutagenese in E.coli herzustellen und durch ein Tetrazyclin induzierbares ektopes Rescuesystem auf der Basis einer Tn7-Transposoninsertion die Replikationseffizienz wiederherzustellen. Die Etablierung dieses Systems wird uns in die einmalige Lage versetzen, das aufgrund seiner Zytotoxizität bisher nicht studierbare virale Regulator-Protein IE2 in verschiedenen Zellsystemen zu exprimieren und seine Funktion durch An- und Abschaltbarkeit im Kontext des viralen Genoms zu untersuchen. Darüberhinaus kann das System der ektopen konditionalen Komplementierung für das Rescue jedes beliebigen essentiellen Genes im viralen Genom verwendet werden.

• DFG Programme: Research Grants