Multifragment-Ligationen von Peptiden und Proteinen mit Transpeptidasen

• Antragsteller: Professor Dr. Dirk Schwarzer
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Biologische und Biomimetische Chemie
• Förderung: Förderung seit 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 527537642

Transpeptidasen dienen als wichtige Werkzeuge der Proteinchemie indem sie chemoenzymatische Ligationen von Peptiden und Proteinen erlauben. Ziel dieses Antrags ist die Etablierung von neuen chemoenzymatischen Ligationsmethoden, mit denen sich viele Peptide und Proteine zu einem Ligationsprodukt kombinieren lassen. Kürzlich berichteten wir von Multi-Peptidligationen durch die Transpeptidase Sortase A über schaltbare Sorting-Motive. Sortase A erkennt und spaltet LPxTG Sorting-Motive an dem Threonin-Rest und ligiert das resultierende Enzym-gebundene Intermediat an ein Peptid mit N-terminalem Glycin-Nucleophil. Wir konnten zeigen, dass auf Peptidebene der Leucin-Rest gegen ein Disulfid-geschützes Cystein ersetzt werden kann, wodurch Sortase-vermittelte Ligationen (SML) möglich werden. Durch Reduktion des Disulfids wird das Sorting-Motiv inaktiviert. In Kombination mit durch photo-labile Gruppen geschützte Nucleophilen werden Multi-Peptidligationen ermöglicht. In dem ersten Teilprojekt wollen wir diese Technologie auf Ebene rekombinanter Proteine etablieren. Dazu sollen unterschiedliche Disulfide in CPxTG-Motiven von rekombinanten Proteinen installiert und mit Protease-aktivierbaren Nucleophilen kombiniert werden. Diese Methode soll für die Herstellung eines Reporterproteins für Inhibitoren von Acetyllysin-Bindemodulen genutzt werden. In einem zweiten Projekt planen wir, schaltbare Prolin-Reste für Multi-Fragment SML zu entwickeln. Der Prolin-Rest im Sorting-Motiv ist essenziell für die Induktion einer gebeugten Konformation ('kink'), die für die Bindung an die Sortase wichtig ist. Zur Induktion des 'Kinks' planen wir den Prolin-Rest gegen Aminosäuren auszutauschen, die eine säure- oder photo-labile Rückgratmodifikation enthalten. Nach der SML soll durch Säurebehandlung oder UV-Bestrahlung die Modifikation entfernt und das Motiv so in eine inaktive lineare Konformation überführt werden. Im letzten Teilprojekt soll ein orthogonales Ligationsschema mit den Transpeptidasen Sortase und Butelase etabliert werden. Zunächst soll eine effiziente rekombinante Produktion der pflanzlichen Butelase etabliert werden, die die natürliche Lokalisation des Enzymes im ER adressiert. Dazu sollen humane Expi293 Zellen und Leishmania tarentolae als Expressionssysteme verwendet werden, die für ER-Lokalisation rekombinanter Proteine optimiert wurden. In einer Ein-Topf-Ligation soll im Folgenden das Reporterkonstrukt für Inhibitoren von Acetyllysin-Bindedomänen assembliert werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen