Functional characterisation of HIMalpha, an E(z) containing histone methyltransferase complex
Final Report Abstract
Die Methylierung von Histonen spielte eine wichtige Rolle bei der Etablierung und Aufrechterhaltung stabiler Genexpressionsmuster. Eine besonders große Rolle in diesem Prozess spielt dabei die Histonmethyltransferase E(z), von der wir und andere zeigen konnten, dass sie in einem Komplex mit fünf weiteren Proteinen vorliegt. Im Rahmen des hier zusammengefassten Projekts war es unser Ziel diesen Komplex genauer zu charakterisieren. Wir konnten alle Untereinheiten in einem baculoviralen Expressionssystem herstellen und, durch gleichzeitige Expression von vier Untereinheiten, einen „Core" Komplex assemblieren und reinigen, der dem aus Fliegenembryos gereinigten Komplex sehr ähnlich ist. Wir konnten außerdem ein neue Isoform einer Untereinheit des PRC2 Komplexes identifizieren, klonieren, exprimieren und zeigen, dass die neue Isoform des ESC Proteins, ESC-L, in einen katalytisch aktiven Komplex eingebaut werden kann. In dem verwendeten Expressionssystem konnten wir weiterhin die Interaktionen der unterschiedlichen Untereinheiten untereinander charakterisieren und damit ein molekulares Model des PRC2 Komplexes erstellen. Um die biologische Funktion des E(z) Enzyms genauer untersuchen zu können haben wir im Rahmen dieses Projekts ein transientes Transfektionssystem aufgebaut in dem wir zeigen konnten, dass E(z) in der Tat in der Lage ist die aktivierte Transkription zu reprimieren. Da unsere initialen Versuche einen H3K27me3 spezifischen Antikörper zu gewinnen fehlschlugen, haben wir, ebenfalls im Rahmen dieses Projekts, neue Methoden entwickelt, um mit Hilfe der hochauflösenden Massenspektrometrie Histonmodifikationen zu charakterisieren. Die Anwendung dieser neuen Methoden auf Histone unterschiedlicher Entwicklungsstadien erlauben uns nun eine Korrelation der Modifikationen mit der Expression unterschiedlicher histonmodifizierender Enzyme.
Publications
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(2004) A combination of different mass spectroscopic techniques for the analysis of dynamic changes of histone modifications. Proteomics 4: 1382-1396
Bonaldi T, Imhof A, Regula JT
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The use of mass spectrometry as a tool to analyse post translational histone modifications. Methods of Enzymology, 2004;377:111-30
Tiziana Bonaldi, Jörg Regula, Axel Imhof
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ESC, ESCL and their roles in Polycomb Group mechanisms Mech Dev. (2008) Jan 12
Katsuhito Ohno, Donna McCabe, Birgit Czermin, Axel Imhof and Vincenzo Pirrotta
