Bakterielle Lipoatsynthese: Neuartige Enzyme, ungewöhnliche Substrate und neue evolutionäre Perspektiven

• Antragstellerin: Privatdozentin Dr. Christiane Dahl
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung seit 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 525834735

Liponsäure ist in Organismen aller Domänen des Lebens vorhanden und an Schlüsselreaktionen des zentralen Kohlenstoffstoffwechsels und der dissimilatorischen Schwefeloxidation beteiligt. In dieser gesättigten Fettsäure mit acht Kohlenstoffatomen ersetzen Schwefelatome die Wasserstoffatome der Kohlenstoffe 6 und 8 der Acylkette. Zwei posttranslationale Mechanismen für die Synthese der Lipoylgruppe auf ihren Zielproteinen sind gut charakterisiert: Die Nutzung freier Vorstufen oder die de novo Synthese aus Zwischenprodukten der Fettsäurebiosynthese. Kürzlich wurde ein weiterer Weg für den Aufbau dieses wichtigen Biomoleküls entdeckt, der in beiden prokaryotischen Domänen weit verbreitet ist. Bisher war man davon ausgegangen, dass Lipoat:Protein-Ligasen ausschließlich zur Nutzung verfügbaren freien Lipoats verwendet werden. Unsere Arbeit an bakteriellen Schwefeloxidierern zeigt jedoch, dass sie Ligasen enthalten, die an der de-novo Lipoylierung von Proteinen beteiligt sind, und zwar ausgehend von Octanoat als freiem Vorläufer. Der Lipoataufbau wird dann durch den Einbau von Schwefel über zwei radical SAM-Domänen enthaltende Proteine (LipS1 und LipS2) abgeschlossen. Für das Archaeon Thermococcus kodakarensis wurde der Weg kürzlich experimentell nachgewiesen, während Arbeiten an Vertretern der Domäne Bacteria noch ausstehen. Unser Ziel ist es, den neuartigen Lipoatassemblierungsweg in Bacteria im Detail zu charakterisieren, indem wir die folgenden Hauptpunkte angehen: 1. Identifizierung aller am Stoffwechselweg beteiligten Enzyme. 2. Eigenschaften sowie Interaktionen der neuartigen bakteriellen Lipoatassemlierungsproteine, insbesondere im Hinblick auf Unterschiede zu ihren archaealen Gegenstücken. 3. Substratspezifität und Mechanismen der Differenzierung zwischen Substraten bei Lipoylierungswegen, die im selben Organismus parallel laufen. 4. Verbreitung und allgemeine Bedeutung des neuen Lipoylierungsweges mit Schwerpunkt auf der Domäne Bacteria. 5. Ursprung und Evolution von Lipoylierungsmechanismen. Verschiedene experimentelle Ansätze kommen zum Einsatz: Genetische Studien werden die Inaktivierung und Komplementierung von Genen in dem Alphaproteobakterium Hyphomicrobium denitrificans umfassen. Das native LbpA2-Protein wird aus Referenz- und Mutantenstämmen gereinigt und analysiert, so dass wir die einzelnen Assemblierungsschritte den einzelnen Enzymen zuordnen können. Detaillierte biochemische Experimente an den reinen rekombinanten Proteinen werden durch Strukturanalysen ergänzt. Bakterielle apo-LbpA-Proteine werden als native Substrate für in vitro Assays etabliert. Mit unserem Bioinformatik-Tool HMS-S-S werden wir umfangreiche Datenbankanalysen durchführen, den neuartigen Lipoat-Syntheseweg auf dem Stammbaum des Lebens kartieren und seine Verbreitung aufzeigen. Phylogenetische Analysen werden Informationen über die Evolution des neuen Syntheseweges liefern.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen