Gleichzeitige Untersuchung der primären und übergeordneten Proteinstruktur durch native und Top-down-Massenspektrometrie

• Antragsteller: Professor Dr. Frederik Lermyte
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Biochemie ; Biophysik
• Förderung: Förderung seit 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 524226614

Um die Funktion von Biomolekülen, insbesondere von Proteinen, zu verstehen, ist es unerlässlich ihre 3D-Struktur und Wechselwirkungen zu kennen. Dieser Bereich wird als Strukturbiologie bezeichnet und stützt sich traditionell auf Methoden wie Röntgenkristallographie, Kernspinresonanz und in jüngerer Zeit auch auf Kryoelektronenmikroskopie. Diese Methoden sind zwar sehr leistungsfähig, haben aber auch ihre Grenzen. Hierzu zählen z. B. die begrenzte Empfindlichkeit bei der Unterscheidung von Proteinvarianten, die komplexe Probenvorbereitung. Außerdem besteht eine Schwierigkeit darin, gleichzeitig Konformationen zu charakterisieren, die nebeneinander bestehen und/oder sich im Laufe der Zeit umwandeln. Die gleichzeitige Bestimmung der Proteinsequenz, der Konformation und der Bildung und Stöchiometrie von nichtkovalenten Komplexen stellt daher einen wichtigen Engpass in der biologischen und medizinischen Forschung dar. Die Massenspektrometrie (MS) kann sowohl die Sequenz und die Konformation von Proteinen als auch ihren Aufbau zu Komplexen charakterisieren. Bei geeigneter Probenvorbereitung ist sie nahezu universell einsetzbar und kann Prozesse in zeitlichen Dimensionen von Millisekunden bis zu Tagen untersuchen. Die Arbeitsgruppe Lermyte an der TU Darmstadt verfügt über eine hochmoderne Ausstattung sowie über eine positive Bilanz im Bereich der so genannten "nativen" Massenspektrometrie von Proteinkomplexen. Auch verfügen wir über beträchtliche Erfahrung in der Anwendung fortschrittlicher Fragmentierungsmethoden zur Untersuchung der Sequenz intakter Proteine und sind das Zentrum mehrerer Kooperationsnetzwerke, sowohl lokal als auch über verschiedene Kontinente hinweg. Anhand einer einzigartigen Zusammenstellung von Modellproteinen werden wir neue Methoden entwickeln, die die native Ionisierung mit Gasphasenfragmentierung und Ionenmobilitätsmessungen kombinieren. Mit diesen Ansätzen können wir die Primärstruktur, die Faltung, die komplexe Stöchiometrie und die Prozesse der Entfaltung von Proteinen untersuchen. Wir werden unsere Ergebnisse mit veröffentlichten Proteinstrukturen aus klassischen Methoden sowie mit orthogonalen Markierungsversuchen in Lösung, die in unserem Labor durchgeführt wurden, in Beziehung setzen. Darüber hinaus werden wir den Einfluss von Additiven (schwerflüchtige Lösungsmittelzusätzen, Metallkomplexe und Metallkationen) auf die Bewegung von Ladungsträgern (Protonen und Elektronen) während und nach der Elektrospray-Ionisierung untersuchen. Die Mobilität dieser verändert die Fragmentierung von Peptiden und Proteinen, was zu einer umfassenderen Fragmentierung und dadurch einer besseren Charakterisierung der Primärstruktur führen kann. Dieses Projekt wird daher die MS-basierte Charakterisierung aller Ebenen der Proteinstruktur verbessern.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen