Cryo-Elektronenmikroskopie Strukturen und funktionelle Analyse von zellfrei synthetisierten G-Protein gekoppelten Rezeptoren in Komplex mit spezifischen G-Proteinen und nach ko-translationaler Insertion in Nanodiscs.

• Antragsteller: Dr. Frank Bernhard
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Pharmakologie
• Förderung: Förderung seit 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 522414670

Unsere Gruppe hat langjährige Erfahrung in der Optimierung der zellfreien Produktion von Membranproteinen mit speziellem Schwerpunkt auf G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) [Schwarz et al., 2007, Bernhard & Tozawa, 2013, Köck et al., 2022]. Aufgrund ihrer Bedeutung in einer Vielzahl von Krankheiten sind GPCRs von herausragendem Interesse für die pharmazeutische Industrie. Effiziente Produktionsstrategien sind daher essentielle Werkzeuge, um notwendige strukturelle Einblicke zum Verständnis der GPCR Funktion zu erhalten. Allerdings bilden Sensitivität gegenüber Detergentien, Instabilität aufgrund konformeller Dynamik sowie notwendige Disulfidbrücken oftmals große Hürden in der Präparation von GPCRs. Die systematische Verfeinerung von Reaktionsbedingungen und Strategien unserer zellfreien Expressionsplattform ermöglicht nun die Synthese qualitativ hochwertiger Proben kompletter GPCRs und deren Komplexe für funktionelle Studien und strukturelle Analysen mittels Cryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM). Die ko-translationelle Insertion der GPCRs in vorgeformte Nanodisc (ND) Membranen mit maßgeschneiderten Lipidzusammensetzungen sowie die Gegenwart hochaffiner Liganden in der Reaktion unterstützt und stabilisiert dabei die GPCR Faltung. Unser zellfreies System ermöglicht daher in Kombination mit optimierten Redox-Bedingungen und Reinigungsstrategien die Präparation von GPCR Proben zur Cryo-EM Analyse in nur wenigen mL Reaktionsvolumen und in weniger als 24 Stunden. Im entwickelten Prozess können konventionell durch Mutagenese stabilisierte GPCRs, wie z.B. der humane Beta-1 adrenerge Rezeptor (hβ1AR), oder auch bisher weniger erforschte und gentechnisch unveränderte Rezeptoren synthetisiert werden. Wir schlagen zunächst die strukturelle und funktionelle Charakterisierung von drei humanen GPCR/G-Protein Komplexen mit dem thermostabilisierten hβ1AR sowie den unveränderten Histamin-2 (H2R) und Freie Fettsäure-2 (FFAR2) Rezeptoren vor. Für alle drei GPCRs sind bisher keine Komplexstrukturen mit G-Proteinen verfügbar. Wir untermauern die Durchführbarkeit des Projekts mit vorläufigen 3D Cryo-EM Daten der drei adressierten GPCR Komplexe in der Lipidumgebung von Nanodiscs. Die strukturellen Studien werden zudem durch umfassende funktionelle Ansätze ergänzt, die insbesondere eine neu entwickelte Methode zum schnellen Nanotransfer von zellfrei hergestellten GPCR Proben in lebende Zellen beinhalten. Dadurch werden simultane Analysen einer Probe in vivo und in vitro ermöglicht. Zu erwartende Kernaussagen des Projekts sind (i) die erste hochaufgelöste Struktur eines zellfrei hergestellten GPCRs, (ii) die ersten GPCR/ Gαsβ1γ2 Strukturen in Lipid Umgebung, (iii) die ersten Strukturen von H2R, hβ1AR und FFAR2 in aktiver Konformation und im Komplex mit spezifischen G-Proteinen, (IV) Protokolle zur Präparation von GPCR Dimeren und (V) Pilotstudien zur funktionellen Charakterisierung von zellfrei hergestellten GPCRs nach Transfer in einen zellulären Kontext.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Mitverantwortlich: Professor Dr. Volker Dötsch