Aktivierung und katalytischer Mechanismus von Glutamin-Amidotransferasen, untersucht an der Imidazolglycerinphosphat-Synthase aus Thermotoga maritima
Final Report Abstract
Die Glutaminamidotransferasen (GATasen) bilden eine große Enzymfamilie, deren Mitglieder zentrale Reaktionen im Stoffwechsel katalysieren. Wir haben mit der ImGP Synthase aus T. maritima (1:1 Komplex aus Synthaseuntereinheit HisF und Glutaminaseuntereinheit HisH) einen prominenten Vertreter der GATAsen strukturell und funktionell untersucht. Dabei wurden zunächst (i) sowohl die HisF- als auch die HisH- Aktivitäten des Komplexes mittels steady-state Kinetik gemessen, (ii) die katalytisch essentiellen Reste von HisF identifiziert und daraus ein Modell für den Mechanismus der Ringschlussreaktion abgeleitet, (iii) die Röntgenstruktur der isolierten HisF- und HisH-Untereinheiten sowie des HisH:HisF Komplexes in der apo-Form aufgeklärt und dabei ein etwa 25Å langer Ammoniakkanal identifiziert, der die beiden aktiven Zentren mit einander verbindet. Im Weiteren haben wir (iv) die Röntgenstrukturen der ImGP Synthase in Gegenwart verschiedener Liganden gelöst und (v) den Einfluss unterschiedlicher Aminosäureaustausche auf die katalytischen Eigenschaften des Komplexes analysiert. Überraschender Weise zeigten zwei ImGP Synthase Varianten konstitutive Glutaminaseaktivität, d.h. Glutamin wurde von ihnen auch in Abwesenheit eines am aktiven Zentrum von HisF gebundenen Liganden hydrolysiert. Eine gründliche Analyse der Ergebnisse hat uns dazu veranlasst, einen neuartigen Mechanismus der Reaktionskopplung der beiden Untereinheiten zu postulieren. Dieser Mechanismus beruht darauf, dass die Produkte von HisH eine wichtige Rolle bei der Koordination der Glutaminase- und Synthase-Reaktionen spielen: Gebildetes Glutamat schließt eine Lücke im Kanal und ermöglicht damit den Transport des erzeugten Ammoniak zum aktiven Zentrum von HisF, dessen dortiger Verbrauch wiederum die Voraussetzung für weitere Glutaminhydrolyse darstellt. Der grundsätzlich ähnliche Aufbau von GATasen lässt uns vermuten, dass vergleichbare Mechanismen auch in anderen Vertretern der Familie wirksam sind. Die Analyse multidimensionaler NMR-Spektren mit 13C/15N markiertem HisF Protein deutet darauf hin, dass in absehbarer Zeit die spezifische Zuordnung aller 247 detektierbaren Aminosäuren gelingen kann. Dies wird eine Reihe interessanter Folgeuntersuchungen zum Reaktionsmechanismus (z. B. pKa-Bestimmung der essentiellen Aspartatreste) und zum Ammoniaktransport in der ImGP Synthase ermöglichen.
Publications
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(2001) Imidazole glycerol phosphate synthase from Thermotoga maritima. Quaternary structure, steady-state kinetics, and reaction mechanism of the bienzyme complex. J Biol Chem, 276, 20387-20396
Beismann-Driemeyer, S. and Sterner, R.
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(2002) Structural evidence for ammonia tunneling across the (β/α)8 barrel of the imidazole glycerol phosphate synthase bienzyme complex. Structure, 10, 185-193
Douangamath, A., Walker, M., Beismann-Driemeyer, S., Vega-Fernandez, M.C., Sterner, R. and Wilmanns, M.
