Calciumkanäle und Calciummikrodomänen in Haarsinneszellen der Maus
Anatomy and Physiology
Final Report Abstract
In diesem Projekt wurden Ca2+-Ströme reifer äußerer Haarzellen (ÄHZ) von Maus und Ratte abgeleitet. Obwohl Messungen an ÄHZ von Mäusen extrem schwierig waren und sehr kleine Ströme lieferten, zeigten reife ÄHZ von Ratten (P32) ca. 60 pA große Ströme (Ladungsträger: 10 mM Ba2+). Diese Ströme waren etwa 4mal kleiner als die gleichaltriger innerer Haarzellen (IHZ). Die Zahl afferenter Kontakte beider Typen Haarzellen bildet ebenfalls etwa das Verhältnis 1:4. Nicht nur in Haarzellen von Mäusen, sondern auch von Ratten ließ sich die Cav1.3-UE auf mRNA- und Proteinebene nachweisen. Cav1.3-lmmunreaktivität war am basalen Zellpol der ÄHZ fast perfekt mit CIBP2/RIBEYE, einem Ribbon-Strukturprotein, kolokalisiert. Diese Ergebnisse legen eine afferente Funktion reifer ÄHZ nahe. Die Ca2+-Stromamplituden von IHZ und ÄHZ wurden mit dem Ende der finalen Differenzierung herunterreguliert. Bei IHZ durchliefen sie ein Maximum zwischen P9 und P11, der Phase maximaler Ca2+- Spontanaktivität. Die Abhängigkeit der Aktivierung der Ströme vom Membranpotential, beschrieben durch den Parameter V1/2 veränderte sich während der Entwicklung von IHZ und ÄHZ. Bei reifen ÄHZ lag sie um 9 mV positiver als bei reifen IHZ. Im Cortischen Organ konnte das Vorhandensein einer langen Cav1.3 und einer verkürzten Splicevariante Cav 1.3 42A nachgewiesen werden, wobei letztere die negative Kanalaktivierung fördert. Die auxiliären Cavß-UE 1-4 konnten alle mit RT-PCR im Cortischen Organ und in selektiv gewonnenen IHZ und ÄHZ nachgewiesen werden. Messungen von Ba2+-Strömen ergaben signifikante Unterschiede zwischen knockouts und Kontrollen hinsichtlich folgender Parameter: beim Fehlen von Cavß3+: lmax, Steilheit k und Grad der Inaktivierung bei neonatalen ÄHZ, Aktivierungszeitkonstante T bei neonatalen IHZ; beim Fehlen von Cavß4+: k und T bei neonatalen ÄHZ, lmax, k und VV2 sowie Membrankapazität bei neonatalen IHZ. Daraus lässt sich schließen, dass Cavß3 oder Cavß4 in jungen IHZ und ÄHZ sehr wahrscheinlich an der Ca2+- Kanalbildung beteiligt sind, ihr Fehlen sich jedoch nicht gravierend auf den Ca2+-Strom und die Hörfunktion auswirkt. Die differentielle Sensitivität der hohe Frequenzen (HF) bzw. tiefe Frequenzen verarbeitenden (LF) ÄHZ gegenüber der Gendeletion von Cav1.3- und K+-Kanälen wurde mit immunhistochemischen und molekularen Techniken untersucht. Sowohl Cav1.3 als auch BK-Kanäle zeigten Expressionsgradienten mit entgegengesetzter Ausrichtung. Proteine, die entweder nur im HF- oder LF-Bereich exprimiert waren, sind das Otoferlin (nur LF) und der postsynaptische Glutamatrezeptor 4 (nur HF). Proteine mit gradueller bzw. frequenzspezifischer Expression stellen Kandidatengene für HF- bzw. LF-Schwerhörigkeit dar. Die Untersuchung der Folge von Schilddrüsenhormon- (TH-) Mangel ergab, dass unter Normalbedingungen die Expression von Cav1,3-Strömen nach der ersten postnatalen Woche durch TH herunterreguliert wird. Bei TH-Mangel wurde auch der BK-Kanal nicht exprimiert, was zu einer verlängerten Phase der Spontanaktivität führte. An Cav1.3-Strömen in Haarzellen wurden Dosis-Wirkungs-Kurven für 3 Klassen von Ca2+-Kanal- Antagonisten (Dihydropyridine, Phenylalkylamine und Benzothiazepine) bestimmt. Die ermittelten IC50-Werte waren generell um den Faktor 40 bis 100 größer als jene für dieselben Blocker an Cav1.2-Kanälen, die besonders im Myokard und in glatter Muskulatur exprimiert werden.
Publications
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