Stem cell based bone grafting
Final Report Abstract
Zielsetzung des Projektes war die Entwicklung eines Herstellungsverfahrens zur Produktion von implantierfähigem menschlichem Knochengewebe in vitro. Zunächst musste eine ausreichende Verfügbarkeit knochenbildender Zellen bzw. deren Vorläufer sichergestellt werden. Parallel zu dem sonst hierfür als Ausgangsmaterial verwendeten Knochenmark wurden Zellen erfolgreich aus kleinen Stückchen trabekulären Knochens isoliert und ihr Potenzial sowohl zu Fettzellen (Adipocyten) als auch zu Knochen bildenden Zellen (Osteoblasten) zu differenzieren nachgewiesen. Identisch zu Zellen, die aus Knochenmark isoliert wurden, konnten sie bis zu 10 Passagen unter Beibehaltung ihres Knochen bildenden Potenzials kultiviert werden. Aus jeder Passage konnten die Zellen dabei ohne Schwierigkeiten auf die für ein hypothetisches Implantat relevanter Größe geforderte Zellzahl von 120 Millionen expandiert werden. Die Entwicklung geeigneter Kulturmedien erlaubte die Vermehrung von Vorläuferzellen und deren anschließende zielgerichtete Differenzierung in Osteoblasten. Als ideale Systeme für die Zellvermehrung erwiesen sich adhärente Kulturen in Wannenstapeln, die im Gegensatz zu Suspensionskulturen mit sphärischen oder hexagonalen Mikroträgern (Microcarrier-Kulturen) eine problemlose Abtrennung der Zellen von den Kulturoberflächen ermöglichte und damit einhergehende Zellverluste minimierte. Anschließend wurden geeignete hochporöse, bioresorbierbare Trägergerüste mit den gewonnenen Zellen besiedelt um dort unter optimierten Kultivierungsbedingungen eine extrazelluläre Matrix auszubilden, in der schließlich neue mineralische Matrix gebildet wird. Hierfür kamen neuartige Prototypen von Trägergerüsten aus verschiedenen keramischen oder polymeren Materialien, häufig auch als Komposite zum Einsatz (ß-Tricalciumphosphat, Hydroxylapatit, Polylactid-Polyglycolid-Copolymer, Calciumcarbonat). Diese Materialien haben in vivo die Eigenschaft gemein, eine allmähliche Resorbierung durch den Körper zu erlauben, wobei es im Idealfall im Zuge der Knochenremodelierung durch neugebildeten körpereigenen Knochen ersetzt wird. Die in vitro Kultivierung erfolgte in einem neuartigen Perfusionsbioreaktorsystem mit kontinuierlichem Medienaustausch, das eine komplette Durchströmung durch die interkonnektierenden Poren des Trägergerüstes erlaubte, sowie parallel in konventionellen statischen oder dynamischen Kultivierungssystemen. Um nach einer Implantation ein Absterben des Knochengewebes zu vermeiden, ist es von großer Wichtigkeit, dass das Gewebe möglichst schnell an die körpereigene Blutversorgung angeschlossen wird. Hierzu müssen normalerweise erst die Gefäß bildenden Zellen einwandern um sich dann zu Kapillaren zu organisieren. Um den für diesen Prozess benötigten Zeitraum deutlich zu reduzieren wurden Studien zur Ko-Kultivierbarkeit dieser Zellen mit den Knochen bildenden Zellen eingeleitet. Zunächst wurden mikrovaskuläre Endothelialzellen ebenfalls erfolgreich auf dem Trägermaterial vermehrt. Es stellte sich jedoch heraus, dass eine synchrone Ko-Kultivierung aufgrund von Inkompatibilitäten der Nährmedienansprüche beider Zelltypen nicht durchführbar ist. Demgegenüber erscheint eine zeitlich aufeinander folgende Besiedlung möglich, konnte jedoch nicht mehr experimentell umgesetzt werden. Nach einem entsprechenden Umbau des Bioreaktorsystems wurden auch kleinere Trägergerüste aus verschiedenen Materialien mit osteogenen Zellen besiedelt und kultiviert um anschließend wie vorgesehen für in vivo Versuche nach Göttingen transferiert zu werden.
Publications
- 3-D cultivation and monitoring of bone precursor cells on calcium phosphate scaffolds in fixed bed bioreactors. Int. J. Artif. Org. 26 :829
Jäger V, Barthold M, Fargali S, Majore I, Zghoul N, Stahl F, Rohde M, Mayer H
- Proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells on calcium phosphate scaffolds in fixed bed bioreactors. Tissue Eng. 9 :848
Barthold M, Fargali S, Majore I, Zghoul N, Stahl F, Rohde M, Mayer H, Jäger V
- (2001) Cultivation of primary osteogenic cells in serum-reduced or serum-free culture media: Attachment, proliferation and differentiation. In: Lindner-Olsson, E., Chatzissavidou, N., Lüllau, E. (eds.) 'Animal Cell Technology: From Target to Market', Kluwer Acad, Pub., Dordrecht, Netherlands, pp. 581-583
Barthold, M., Mayer, H., Jäger, V.
- (2003) Optimization of cell culture conditions and comparative analysis of the proliferation and differentiation of human osteoprogenitor cells by DNA microarray analysis and non-invasive methods. Int. J. Artif. Org. 26: 869
Majore, I., Barthold, M., Stahl, F., Schulz, R., Loose, S., Mayer, H., Fargali, S., Jäger, V.
- (2003) Three-dimensional cultivation of rabbit mesenchymal stem cells on bioresorbable, macroporous calcium phosphate scaffolds in vitro. Int. J. Artif. Org. 26: 859
Fargali, S., Barthold, M., Majore, I., Jäger, V.
- (2004) Isolation, Expansion and Characterization of Human Osteogenic Bone Marrow and Trabecular Bone Derived Cells for Reconstruction of in vitro Engineered Bone. Cytotherapy 6: 296-297
Zghoul, N., Barthold, M., Fuhrmann, R., van Griensven, M., Zeichen, J., Jäger, V.
- (2005) 3D-cultivation and characterisation of osteogenic cells for the production of highly viable bone tissue implants. In: Gödia, F., Fussenegger, M. (eds.) 'Animal Cell Technology Meets Genomics', Springer, Dordrecht, Netherlands, pp. 199 - 205
Barthold, M., Majore, I., Fargali, S., Stahl, F., Schulz, R., Lose, S., Mayer, H., Jäger, V.
- (2005) Improved in vitro osteogenesis of multipotential human mesenchymal cells in three-dimensional perfusion culture. Int. J. Artif. Org. 28: 356
Zghoul, N., van Griensven, M., Zeichen, J., Dittmar, K.E.J., Rohde, M., Jäger, V.
- (2005) In vitro cultivation of rabbit mesenchymal stromal cells on 3D bioresorbable calcium phosphate scaffolds for the generation of bone tissue implants. In: Gödia, F., Fussenegger, M. (eds.) 'Animal Cell Technology Meets Genomics', Springer, Dordrecht, Netherlands, pp. 241 - 243
Fargali, S., Barthold, M., Rohde, M., Majore, I., Jäger, V.
