Entwicklung eines automatisierten, zeitaufgelösten High-throughput-Screening Assays zur Quantifizierung von Transkriptionsraten in vitro

• Applicant: Professor Dr. Michael Famulok
• Subject Area: Biochemistry
• Term: from 1998 to 2005
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 5147120

Im Rahmen des von der DFG geförderten Projekts wurde ein auf Reporter-Ribozymen basierendes Verfahren entwickelt, welches die Bestimmung von Transkriptionsaktivitäten in vitro erlaubt. Die prinzipielle Anwendbarkeit des Verfahrens wurde innerhalb dieses Jahres gezeigt und publiziert [A. Jenne, W. Gmelin, N. Raffler, M. Famulok, Angew. Chem. Int. Ed. 38 (1999), 13001303]. Auf Grundlage dieses Reporter-Systems soll nun ein "High-throughput-Screening (HTS) Assay" entwickelt werden, der die schnelle, automatisierte Identifizierung von Transkriptionsinhibitoren und -aktivatoren ermöglicht. Desweiteren soll das Verfahren angewandt werden, um Mechanismen der pro- und eukaryontischen Transkription (z.B. den Einfluß von Enhancern) zu untersuchen. Der Assay besteht aus einem Ribozym-codierenden DNA-Vektor und einem Oligonukleotid-Substrat, das vom Ribozym gespalten wird. Bei Spaltung des FRET-markierten Substrats (FRET = Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer) durch das Reporter-Ribozym, wird ein Fluoreszenz-Signal erzeugt, das der Menge an transkribiertem Ribozym proportional ist. Zeitabhängige Messung des spaltungsbedingten Fluoreszenzanstiegs erlaubt die schnelle, nicht-radioaktive Quantifizierung von Transkriptionsaktivitäten unter vielen verschiedenen Bedingungen. Ferner wollen wir mit dem Repaortersystem Substanzen und natürliche Interaktoren aus großen Substanzbibliotheken identifizieren, welche die Transkription gezielt beeinflussen.

• DFG Programme: Research Grants