Molekularbiologische Charakterisierung des Flavoenzyms EpiD und biochemische Analyse der Peptidyl-Aminoenthiolat-Reaktionsprodukte

• Applicant: Privatdozent Dr. Thomas Kupke
• Subject Area: Metabolism, Biochemistry and Genetics of Microorganisms
• Term: from 1998 to 2002
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 5137854

Der Schwerpunkt des beantragten Projektes ist die weitere molekularbiologische und biochemische Charakterisierung des FMNhaltigen Flavoenzyms EpiD. EpiD ist an der Biosynthese des Lantibiotikums Epidermin beteiligt. Unter Lantibiotika versteht man Peptide, die die Thioetheraminosäure Lanthionin enthalten, und antimikrobielle Aktivität besitzen. Lantibiotika werden als Vorläuferpeptide ribosomal synthetisiert und anschließend posttranslationell modifiziert. EpiD katalysiert die oxidative Decarboxylierung des C-terminalen Cysteinrestes des EpiderminVorläuferpeptids EpiA. EpiD gehört zu einer neuen Familie von Flavoproteinen, für die die Bezeichnung HEPG-Proteine eingeführt wird. Im bisherigen Verlauf des Forschungsprojektes wurden durch Ortsspezifische Mutagenese Aminosäurereste von EpiD identifiziert, die entweder wichtig für die Coenzymbindung (C8, S37, H67, P81, S83, N85, K89, G93, D96, P114) oder für die enzymatische Aktivität (H67, N115 und M120) sind. Ferner wurde das homologe Enzym der Mersacidinbiosynthese, MrsD, exprimiert, als Fusionsprotein gereinigt und als FAD-haltiges Flavoenzym identifiziert. In der Arbeitsgruppe von Dr. S. Steinbacher/Prof. Dr. R. Huber gelang die Kristallstrukturanalyse von EpiD. Außerdem gibt es erste Ergebnisse zur Kristallstruktur von MrsD. EpiD und MrsD liegen als Homododekamere vor (Tetramere von Trimeren). Die für die Strukturanalyse benötigten Überexpressionsklone wurden in Tübingen konstruiert.

• DFG Programme: Research Grants