Kinetik der Proteinkristallisation im skalierbaren Rührkristallisator als Funktion der relativen molekularen Kontaktstabilitäten von Mutanten einer Alkoholdehydrogenase

• Antragsteller: Professor Dr.-Ing. Dirk Weuster-Botz
• Fachliche Zuordnung: Bioverfahrenstechnik
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 511354413

Eine Ursache für den bisher geringen industriellen Einsatz der Proteinkristallisation in der Aufarbeitung ist die fehlende Kristallisierbarkeit vieler Proteine, da diese durch die Evolution darauf trainiert wurden, nicht zu kristallisieren, um ihre biologischen Funktionen sicher zu stellen. Unsere bisherigen Forschungsarbeiten beschäftigten sich daher mit der rationalen Mutagenese von Aminosäureresten an den Kontaktstellen von Proteinen in Kristallen, um den Kristallisationsprozess gezielt verbessern zu können. Am Beispiel der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus brevis (LbADH) konnten so durch gezielten Austausch von einzelnen Aminosäuren Mutanten identifiziert werden, die besser kristallisierten. Mit Hilfe von Molekulardynamik (MD) Simulationen gelang es uns darüber hinaus zu zeigen, dass bessere oder verringerte Kristallisierbarkeit der Mutanten lediglich von der relativen Stärke der Wechselwirkungen an den Kristallkontaktstellen abhängen. Da hierzu vollständige Atom-MD-Simulationen verwendet wurden, werden entropische und enthalpische Effekte sowohl für das Lösemittel Wasser als auch für das Protein berücksichtigt, um die relative molekulare Kontaktstabilität von Proteinmutanten quantitativ bestimmen zu können.Relevant für technische Anwendungen ist neben der erreichbaren Ausbeute im thermodynamischen Gleichgewicht insbesondere die Geschwindigkeit von Keimbildung und Kristallisation im skalierbaren Rührkristallisator. Die wissenschaftliche Fragestellung ist daher: Welchen Einfluss hat die relative molekulare Kontaktstabilität auf die Kristallisationskinetik von Enzymmutanten im Rührkristallisator unter vergleichbaren Bedingungen und können Vorhersagen zu Kristallisationsgeschwindigkeiten im Vergleich zum nativen Protein erfolgen? Diese Untersuchungen sind jetzt erstmalig möglich, da vergleichbare Bedingungen tatsächlich auch realisiert werden können, da jeweils nur geringfügig veränderte Proteine (Austausch von 1 Aminosäurerest) unter identischen Bedingungen bei der Sättigungskristallisation untersucht werden können. Zur Messung der Keimbildungs- und Kristallisationskinetik in ruhender Lösung soll die dynamische Lichtstreuung eingesetzt werden, mit der die Aggregation von Proteinen oder die Bildung von Nanokristallen von 1 – 1000 nm dynamisch erfasst werden kann. Damit ist die Kinetik von Keimbildung (Aggregatbildung) und Nanokristallwachstum ausgehend vom LbADH-Tetramer in Lösung (6-8 nm) über einen weiten Größenbereich dynamisch erfassbar. Zur dynamischen online Erfassung von Kristallzahl und -größenverteilung im Rührkristallisator soll die in-situ Mikroskopie mit entsprechender automatisierter Bildauswertung verwendet werden. Mit Hilfe dieser Messmethoden kann damit erstmalig quantitativ erforscht werden, wie die relative molekulare Kontaktstabilität von Proteinmutanten sowohl Keimbildungs- als auch Kristallwachstumskinetik bei der Sättigungskristallisation im Rührkristallisator unter vergleichbaren Bedingungen beeinflusst.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Großgeräte: In-situ Mikroskopsonde
• Gerätegruppe: 5040 Spezielle Mikroskope (außer 500-503)