Signalübertragung durch ein Pflanzen-ähnliches Cryptochrom in Diatomeen

• Antragstellerin: Professorin Dr. Claudia Büchel
• Fachliche Zuordnung: Biochemie und Biophysik der Pflanzen
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 510972827

Cryptochrome sind Photorezeptoren, die in allen Bereichen des Lebens zu finden sind. Pflanzen-ähnliche Cryptochrome wurden erst kürzlich identifiziert. Sie kommen in Stramenopilen und damit in Diatomeen vor, aber auch in Chlorophyta und Tieren wie Teleostern und Anneliden. Das CryP der Diatomee Phaeodactylum tricornutum gehört in diese Gruppe und wir konnten zeigen, dass es als Blaulichtrezeptor fungiert. Wenn CryP in E. coli exprimiert wird, ist FAD in Form des semireduzierten Radikals (FADH•) gebunden. Dieses hat Absorptionsmaxima auch im roten und gelben Bereich des Spektrums. An CryP gebundenes FADH• ist ungewöhnlich stabil. Während eine reversible Reduktion zu FADH2 möglich ist, ist die Oxidation zum voll oxidierten FAD extrem langsam. Dies hat zu der Hypothese geführt, dass FADH• der Dunkelzustand des CryPs ist. Gene für die üblichen Protein-Interaktionspartner pflanzlicher Cryptochrome fehlen in Diatomeen. Die Signaltransduktion muss daher anders erfolgen und von Grund auf aufgeklärt werden. Wir konnten Protein-Interaktionspartner von CryP identifizieren: einen möglichen Transkriptionsfaktor, BolA, und ein Protein unbekannter Funktion, ID42612. Diese Experimente erfolgten in vitro und die Lokalisation dieser Proteine in der Zelle ist unklar, sowie ihre Interaktion mit CryP in vivo. Vorläufige Experimente konnten zudem eine blaulichtabhängige Degradation von CryP zeigen. Um einige entscheidende Schritte der Signaltransduktion von CryP weiter aufzuklären, verfolgen wir folgende drei Ansätze: (1) Der Dunkelzustand von CryP in vivo soll nachgewiesen werden. Dazu werden wir die Expressionslevel von Genen, die durch CryP beeinflusst sind, nach Belichtung mit Blau-, Gelb-, oder Rotlicht im Vergleich zur Dunkelinkubation im WT und in CryP-Knock-Out Mutanten quantifizieren. Falls FADH• der Dunkelzustand ist, sollte im WT eine Änderung der Expressionslevel bei allen Lichtfarben gleichermaßen erkennbar sein, welche den Mutanten fehlt. (2) Die Interaktion von CryP mit BolA und ID42612 und der Ort der Interaktion innerhalb der Zellen soll in vivo nachgewiesen werden. Hierzu werden wir biFC in der konfokalen Mikroskopie nutzten, d.h. Teile von GFP, die bei Nähe zur vollständigen Chromophore assemblieren, an CryP bzw. seine Interaktionspartner koppeln. (3) Degradation von CryP beendet das Signal und eine mögliche Funktion von ID42612 liegt darin, entweder in den Abbau involviert zu sein – direkt oder durch Rekrutierung von Proteasen – oder den Abbau zu verhindern. Dies werden wir anhand von in E. coli exprimiertem CryP untersuchen, welches mit Zellextrakt aus P. tricornutum unter Belichtung mit verschiedenen Farben oder in Dunkelheit inkubiert wird. Der Abbau kann via Immunoblots verfolgt werden und Inhibitorstudien können zeigen, welche Art von Proteasen involviert sind. Zusammenfassend wird dieses Projekt dadurch einen ersten Einblick in die ungewöhnliche Signaltransduktion eines Pflanzen-ähnlichen Cryptochromes erlauben.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen