The Activator (Ac) element from maize: transposition mechanism and regulation and advancement as a mutagenesis tool
Final Report Abstract
Das transponierbare Element Activator (Ac) aus Mais behält auch in fremden Wirtspflanzen einige nützliche Eigenschaften bei, so zum Beispiel die Präferenz zur Insertion in genreiche euchromatische Chromosomenregionen, und ist deshalb besonders gut zur Insertionsmutagenese in Pflanzen mit großen Genomen geeignet. Nachteilig ist dagegen die in einigen Pflanzen sehr niedrige und bislang nicht gezielt steuerbare Transpositionsfrequenz von Ac. Die Zielsetzungen dieses Projekts sind die bislang nur schlecht verstandene (Auto)Regulation von Ac aufzuklären, die Transposition steuerbar zu machen, die Transpositionsaktivität der Ac Transposase (AcTPase) zu verbessern und die Anwendbarkeit von Ac zur Mutagenese in Säugerzellen zu untersuchen. Um dies zu erreichen wurden gezielt mutagenisierte AcTPase-Derivate erzeugt um das katalytische Zentrum des Proteins zu charaktierisieren, die Multimerisierung und Aggregationsneigung der AcTPase in vitro und in vivo zu untersuchen und um AcTPase-Derivate mit erhöhter Transpositionsaktivität zu identifizieren. Durch Sequenzvergleiche mit anderen Transposasen aus der Familie der hAT-Transposons wurde eine D301/D367/E719-Aminosäuretriade identifiziert, wie sie in vielen Transposasen der DDE-Rekombinase-Superfamilie im aktiven Zentrum zu finden ist. Der Austausch jeder dieser Aminosäuren in der AcTPase gegen Alanin führte zu einem vollständigen Verlust der Transposaseaktivität. Dieses Ergebnis ist konsistent mit der postulierten Rolle dieser Aminosäuren im katalytischen Zentrum. Um die Multimerisierung und Aggregation der AcTPase zu analysieren wurde das Protein statt wie bisher in E. coli in Saccharomyces cerevisiae exprimiert. Es gelang jedoch weder mit direkt aus den Zellen isoliertem noch nach einem De- und Renaturierungsschritt gereinigtem Protein die Löslichkeit zu erhöhen. Wie das Protein aus E. coli zeigte auch die AcTPase aus Hefe in vitro keine Endonukleaseaktivität. Auch die Substitution von Aminosäuren an Positionen, die in anderen Transposasen zu einer verbesserten Löslichkeit führen blieb bei der AcTPase ohne Erfolg. In vorangegangenen Versuchen wurden AcTPase-Mutanten mit anscheinend erhöhter Transpositionsaktivität isoliert. Diese Mutanten wurden in einem Hefe-Transpositionsassay und in Pflanzenprotoplasten genauer analysiert. Eine Mutante mit vier Aminosäuresubstitutionen zeigte in Hefe eine etwa 100fach erhöhte Ds-Exzisionsfrequenz und zusätzlich eine zweifach höhere spezifische Reintegrationsfrequenz. Das mutierte Protein katalysiert auch in Petunienprotoplasten eine erhöhte Ds-Exzisionsfrequenz. Gegenwärtig wird die Aktiviät der AcTPase-Mutanten in transgenen Arabidopsispflanzen untersucht. Für Transposon-basierte Mutageneseversuche im großen Maßstab ist neben der Transpositionshäufigkeit eine eventuelle Gewebe- und Entwicklungsspezifität ein wichtiger Faktor. Da die bislang zur Verfügung stehenden Testsysteme nicht für die Analyse einer größeren Zahl von Transposasemutanten geeignet sind wollen wir verbesserte Assays entwickeln. Wir haben verschiedene Fusionen der eGFP und PAT (BASTA-Resistenz) Proteine hergestellt die zur Beurteilung der Transpositionsfrequenz in verschiedenen Organen und in den Gameten geeignet sein sollen. Es stellte sich heraus, dass der Expressionslevel von eGFP in unabhängigen Arabidopsis-Transformanten sehr stark variiert. Da in den Reporterlinien die eGFP Expression durch das inserierte Transposon blockiert wird, ist die Suche nach Linien, in denen die Expression nach Exzision ausreichend für die Detektion von Transpositionsereignissen sein wird, sehr schwierig und noch nicht abgeschlossen. Weil in transgenen Arabidopsispflanzen nur eine relativ geringe Zahl an Transposasevarianten getestet werden kann, entwickeln wir für ein Vorscreening ein transientes Assay in agroinfiltrierten Tabakblättern. In Zusammenarbeit mit Dr. Zoltan Ivics (MDC, Berlin-Buch) untersuchen wir die Eignung des Ac Transposons aus Mais für die Insertionsmutagenese in menschlichen Zellen. Bislang konnten wir keine Transposition in HeLa-Zellen entdecken, aber die Versuche sind noch nicht abgeschlossen.
