Entwicklung eines Chem-CRISPR/dCas9-Systems für Niedermolekulare Verbindung-vermittelten Epigenomedition auf Einzelgenebene

• Antragsteller: Dr. Xinlai Cheng
• Fachliche Zuordnung: Pharmazie ; Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 509482700

Epigenetische Aberration ist einer der wichtigsten Faktoren für die Initiation, Promotion und das Wachstum bzw. die damit einhergehende Ausbreitung von humanitärem Krebs. Oftmals wird die epigenetische Aberration mit einer erworbenen therapeutischen Resistenz assoziiert. Eine Vielzahl von präklinischen Studien berichten von epigenetischen Modulatoren, die auf einer chemischen Grundlage basieren. Diese zeigten sowohl bei Tierversuchen, als auch in klinischen Studien, dass einer der essenziellsten Gründe für das Scheitern der Epidrug-Entwicklung die starke On- und Off-Target-Toxizität ist. Eine der effizientesten Methoden für eine präzise epigenetische Regulation auf Einzelgenebene ist die Verwendung der CRISPR/dCas9 Technologie. Dieser Ansatz erfordert die ektopische Expression von exogenen epigenetischen Modulationsproteinen, welche nachweislich zu problematischen Nebenwirkungen führen können. Unser Forschungsgebiet befasst sich mit der Entwicklung einer chemisch-basierenden CRISPR/dCas9 Plattform. Durch das CRISPR/dCas9-System können chemisch synthetisierte Moleküle, welche als epigenetische Aktivatoren und Inhibitoren fungieren, in die Nähe der gewünschten DNA-Sequenz gebracht und für eine Modulation auf der Einzelgenebene genutzt werden. In unseren bereits durchgeführten Studien haben wir mehrere Ansätze ortsselektiver chemischer Modifikationen getestet und das TT-Clamp-System erfolgreich an die Chem-CRISPR/dCas9-Plattform angepasst. Wir konnten experimentell nachweisen, dass (d)Cas9, welches die kurze Phe(F)-Cys(C)-Pro(P)-Phe(F)-Aminosäuresequenz markiert, spezifisch von Perfluoraromaten in der Zelle erkannt wird. Experimentell wurde der Perfluoraromat-basierende Binder mit FITC gekoppelt, wodurch die Markierung von Cas9 möglich war. In unserem Arbeitskreis entwickelten wir außerdem einen heterobifunktionales PROTAC, welches FPCF und Thalidomid bindet. Thalidomid ist ein Ligand der E3-Ligase Cereblon, weshalb unser PROTAC nachweislich zur Degradierung von (d)Cas9FCPF und weiterer CasFCPF-Proteine führt. In der Vorarbeit für diesen Antrag haben wir JQ1, einen Pan-BET-Inhibitor, mit FCPF konjugiert und somit erstmals den FCPF-JQ1 Binder synthetisiert, welcher im FRET-Assay die induzierte Annäherung von dCas9FCPF und BRD4WT bestätigt. Diese Befunde wurden weiterhin durch Co-Immunpräzipitation bestätigt. Die Untersuchung der Transkription auf genomischer Ebene zeigt, dass C-MYC in Gegenwart von JQ1-FCPF und dem Chem-CRISPR/dCas9FCPF-Systems sowie einem Enhancer für C-MYC und dem sgRNA Promoter reprimiert wird. In dem vorgeschlagenen Projekt werden wir eine Vielzahl von neuartigen FCPF-Konjugaten mit einer potenziellen Fähigkeit zur epigenetischen Modulation synthetisieren. Damit wollen wir die Anwendungen und das damit einhergehende Potential des Chem-CRISPR/dCas9FCPF-Systems zur Regulierung von Epigenom Veränderungen auf Einzelgenebene demonstrieren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen