Zeitaufgelöste Katalyse und Allosterie in der Tryptophansynthase als Modell für Bienzymkomplexe mit einem Produkt/Substrat-Tunnel zwischen zwei aktiven Zentren

• Antragstellerinnen / Antragsteller: Dr. Andrea Hupfeld; Professor Matthias Wilmanns, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Strukturbiologie
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 508072649

Allosterische Bienzymkomplexe sind raffinierte Enzymmaschinerien mit zwei aktiven Zentren, welche durch einen Produkt/Substrat-Tunnel miteinander verbunden sind. Sie koordinieren zwei katalytische Schritte in einer höchst anspruchsvollen Art und Weise. Bisherige Studien aus umfangreichen biochemischen und strukturbiologischen Ansätzen konnten nur einen begrenzten Einblick in den Katalysemechanismus, die allosterische Regulation der Aktivität sowie in die damit assoziierten Konformationsänderungen dieser Enzyme geben. In diesem Projekt soll eine neue Strategie für die Untersuchung von Bienzymkomplexen implementiert werden, welche auf der Kombination von Licht-sensitiven unnatürlichen Aminosäuren (UAA) und zeitaufgelöster serieller Röntgenkristallographie (TRX) zur zeitlichen Auflösung der Katalyse, der Allosterie und des Produkt/Substrat-Transports basiert. Zu diesem Zweck soll die Tryptophansynthase (TS) als Pilotsystem genutzt werden. Aufgrund der bereits zur Verfügung stehenden umfangreichen biochemischen und strukturellen Daten über die katalytischen Reaktionen und Allosterie-basierten Konformationsänderungen ist dieser Bienzymkomplex hervorragend für unsere Studien zum Konzeptnachweis geeignet. Das Projekt wird dazu in drei Phasen strukturiert. In Phase I werden die beiden Forschungsgruppen komplementäre, experimentelle Daten akquirieren. Eine Gruppe wird TS-Mutanten mittels Licht-sensitiver UAAs konstruieren, welche Konformationsänderungen oder den Transport von Produkt/Substraten blockieren und nach Belichtung diese Blockade lösen. Diese Enzymmutanten werden dann biochemisch und biophysikalisch charakterisiert, um geeignete Kandidaten für anschließende zeitaufgelöste strukturelle Untersuchungen auszuwählen. Die andere Gruppe wird währenddessen TRX Experimente für die TS durchführen, in denen die Reaktion durch Ligandendiffusion initiiert wird. Schließlich werden die konstruierten Licht-sensitiven TS-Mutanten mit TRX strukturell charakterisiert, indem die Reaktion durch Laser-Bestrahlung induziert wird. Beide TRX Ansätze sind komplementär hinsichtlich wesentlicher experimenteller Anforderungen wie der Homogenität der Initiierung, der präzisen Kontrolle des Reaktionsstartpunktes, zugänglicher Zeitintervalle und der allgemeinen Umsetzbarkeit des experimentellen Ansatzes. In Phase II werden beide Gruppen ihre Ergebnisse interpretieren und zu einer kompletten zeitaufgelösten Darstellung oder einem „Film“ der TS Katalyse und Allosterie kombinieren. In Phase III werden die Erkenntnisse weitergehend analysiert, um generelle Rückschlüsse in Bezug auf drei Themen von breiter Signifikanz zu ziehen: i) der Mechanismus anderer Bienzymkomplexe mit Produkt/Substrat-Tunnel zwischen zwei aktiven Zentren, ii) die Entwicklung von smarten, Licht-sensitiven Antibiotika für die TS und iii) die Evolution der TS Katalyse und Allosterie.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen