Die Rolle der DEAD-Box-Helikasen CshA und CshB bei der bakteriellen Qualitätskontrolle der Translation

• Antragsteller: Alan Rodriguez Carvajal, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Biochemie ; Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 503872807

Die ordnungsgemäß funktionierende Translation ist eine Grundvoraussetzung für alle lebenden Zellen. Unterschiedliche Arten von Translationsstress können dazu führen, dass Ribosomen ins Stocken geraten. Nachfolgende Ribosomen kollidieren mit dem blockierten, führenden Ribosom und bilden so eine einzigartige Disomstruktur. Kollidierte Disome aktivieren Signalwege zur Ribosomenrettung und den nachgeschalteten Ribosomen-Qualitätskontrollweg (RQC-Weg), der für den Abbau der unvollständigen naszierenden Kette und für die Wiederverwendung ribosomaler Untereinheiten sorgt. Unser Labor konnte erstmalig den bakteriellen RQC-Weg beschreiben, welcher homolog zu dem eukaryotischen RQC-Weg ist. Des Weiteren, konnte in unserem Labor die neuartige Komponente MutS2 charakterisiert werden, welche kollidierte Disome in Bakterien erkennt. Im Rahmen der Analyse von MutS2 wurden die RNA-Helikasen CshA und CshB als potentielle Ribosomen-Rettungsfaktoren identifiziert. In diesem Projekt wollen wir die Rolle von CshA und CshB bei der bakteriellen Ribosomenrettung und dem RQC-Weg charakterisieren. Unser erstes Ziel ist es, festzustellen, ob die Helikasen bei der Spaltung von Ribosomen und/oder dem mRNA-Abbau als Reaktion auf Ribosomenkollisionen eine Rolle spielen. Dazu werden wir zunächst Helikase-knock-out Zelllinien erzeugen, um einen genetischen Zusammenhang zwischen dem Ribosomen-Rettungssignalweg und dem RQC-Weg herzustellen. Als RNA-Helikasen könnten CshA und CshB an der Ribosomenspaltung beteiligt sein oder Komponenten des mRNA-Abbaus sein, welcher der Ribosomenrettung nachgeschaltet ist. Um ihre Funktion zu bestimmen, werden wir die Assoziation der Helikasen mit dem Ribosom durch Dichtezentrifugationsexperimente charakterisieren und ihre Fähigkeit testen, kollidierte Disome in vitro zu spalten. Außerdem werden wir die Stabilität von Translationsstillstand induzierenden Reporter-mRNAs in Abwesenheit von CshA und CshB testen. Das zweite Ziel dieser Arbeit ist die kryo-elektronenmikroskopische Bestimmung der Strukturen von CshA und CshB welches an ribosomale Partikel gebunden ist. Zu diesem Zweck werden wir helikasegebundene Ribsomen durch Immunpräzipitation von CshA und CshB aufreinigen. Durch die gut charakterisierte Struktur des Ribosoms können wir zusätzliche Dichten identifizieren, die den Helikasen entsprechen. Die Assoziation der beiden Helikasen mit dem Ribosom konnten wir bereits bestätigen, und haben erste 3D-Rekonstruktionen aus CshA-Immunopräzipitationen erstellt. Aufgrund ihrer evolutionären Konservierung könnte die Charakterisierung des bakteriellen Ribosomen-Rettungssignalweges und des RQC-Weges weitere Einblicke in homologe eukaryotische Signalwege liefern, welche in neurodegenerative Erkrankungen involviert sind. Darüber hinaus könnten Komponenten des bakteriellen Ribosomen-Rettungssignalweges und des RQC-Weges gute Kandidaten für die Entwicklung neuer therapeutischer Wirkstoffe für den Einsatz in kombinatorischen Antibiotika-Behandlungen sein.

• DFG-Verfahren: WBP Stelle