Regulation der Dynamik und Funktion von Podosomen durch Podosomen Kappe und Basis

• Antragsteller: Professor Dr. Stefan Linder
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 502808895

Podosomen sind Adhäsions- und Invasionsstrukturen insbesondere von monozytären Zellen wie Makrophagen. Sie erfüllen eine Vielzahl von Funktionen wie Zell-Matrix Adhäsion, Abbau extrazellulärer Matrix oder Mechanosensing und sind von zentraler Bedeutung für Immunzell-Migration und Invasion. Die Vielzahl podosomaler Funktionen bedingt eine genaue zeitliche und räumliche Kontrolle. Entsprechend bestehen Podosomen aus mehr als 300 Komponenten, und ihre Architektur ist hochkomplex. Dieses Projekt befaßt sich mit zwei kaum untersuchten Substrukturen von Podosomen, der Kappe, die dem Aktin-reichen Kern aufliegt, sowie der Basis an der Grenzfläche von Zelle und Substrat. Wir konnten den Aktin-Bündler und Endozytose-Regulator Swiprosin-1, das Formin INF2 und den Aktin-Regulator Drebrin als neue Komponenten der Kappe sowie die Myosine Myo1e und Myo1f als Bestandteile der Basis identifizieren. Jedes der Proteine beeinflußt spezifische Aspekte von Podosomen Dynamik, Architektur und Funktion beeinflußt, ebenso den Kontakt zu Mikrotubuli Plus-Enden, einer Voraussetzung für regelhafte Podosomen-Dynamik. Die entsprechenden molekularen Mechanismen sind jedoch ungeklärt. Zudem ist unklar, wie sich beide Substrukturen mit Kern und Ring integrieren, um ein voll funktionsfähiges Podosom zu bilden. Wir werden die spezifischen Rollen dieser neuen Kappen und Basis Komponenten bei der Regulation von Podosomen Dynamik und Funktion aufklären. Das Arbeitsprogramm umfaßt 4 Punkte, wobei sich die Punkte 1-3 auf bestimmte Proteine fokussieren, während Punkt 4 für alle untersuchten Proteine gilt. Hier sollen spezifische Interaktionen zwischen Komponenten der Kappe und Basis identifiziert, aber auch weitreichendere Interaktome sowie die Architektur der Substrukturen aufgeklärt werden. Hierbei kommt eine Kombination von Methoden zum Einsatz: i) molekularbiologische Techniken wie siRNA-vermitteltem knockdown, Expression von Fusions-, Mutations- und rescue-Konstrukten, Coimmunopräzipitation, GST/MBP pulldown, Aktin Cosedimentation und Phosphoinositol Bindungs Assays, ii) mikroskopische Methoden wie konfokale Lebendzell-Mikroskopie sowie verschiedene Methoden der Hochauflösungs-Mikroskopie (3D STED, SoRa), iii) Software-basierte Analyse von Podosomen Parametern, Architektur und Kontakt mit Mikrotubuli Plus Enden, sowie iv) komplexe Zell-basierte Assays wie Matrix Degradations Assays, proximity ligation assays, sowie BioID Markierung mit Massenspektrometrie Analyse. Dafür haben wir Kooperationen mit nationalen (Dirk Mielenz, Swiprosin-1) und internationalen (Mira Krendel; Myo1e, Myo1f) Experten etabliert. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen werden die molekularen Mechanismen der Podosomen Kappe und Basis, sowie ihre Rollen bei der Regulation von Podosomen Architektur, Dynamik und Funktion aufzeigen. Unsere Daten werden somit auch einen zentralen Beitrag zu einem vertieften Verständnis der invasiven Migration von primären humanen Immunzellen in Gesundheit und Krankheit leisten.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen