Aufdeckung des Mechanismus des Sphingosintransports an der Lysosom-ER-Kontaktstelle

• Antragstellerin: Dr. Denisa Jamecna
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 497041072

Eukaryotische Zellen haben ein ausgeklügeltes System entwickelt, um die spezifische organelläre Lipidzusammensetzung aufrechtzuerhalten. Neben Phospholipiden und Sterolen sind Sphingolipide ein wichtiger Baustein der Zellmembranen. Das Hauptrückgrat der Sphingolipide, Sphingosin, wird durch den Abbau komplexer Sphingolipide im Lysosom gebildet und in das ER zur Wiederverwendung in anabolen Stoffwechselwegen exportiert (recycelt). Defekte beim Recycling von Sphingolipiden treten bei schweren Erkrankungen auf, die als Sphingolipidosen bezeichnet werden, sind aber auch ein Merkmal von häufigeren Krankheiten wie Parkinson und Alzheimer. Trotz ihrer Bedeutung für die zelluläre Lipidhomöostase bleibt die Maschinerie, die am Sphingosinrecycling beteiligt ist, völlig unbekannt.Unter der Verwendung neuartiger multifunktionaler Lipidsonden, die im Labor von Dr. Höglinger entwickelt wurden, zielt das vorgeschlagene Projekt darauf ab, Sphingosin-transportierende Proteine zu identifizieren, die an der Lysosom-ER-Grenzfläche operieren, sowie molekulare Merkmale des proteinvermittelten Sphingosintransports aufzuklären.Die im Labor synthetisierten photoaktivierbaren („caged“) und klickbaren Sphingosinsonden reichern sich in Lysosomen an und ähneln bei Aktivierung durch Licht („uncaging“) stark dem natürlichem Sphingosin, sodass sie in die gleichen Stoffwechselwege eintreten und mit den gleichen Proteinen interagieren können. Unter Verwendung von Dünnschichtchromatographie, Lipid-Massenspektrometrie sowie Immunfluoreszenz-Mikroskopie werden die vorgeschlagenen Arbeiten die metabolischen Umwandlungen und den intrazellulären Fluss der lysosomalen Sphingosinsonde verfolgen. Erkenntnisse über die Zeitskalen des Metabolismus und der Verteilung werden dann in proteomische Folgeexperimente einfließen. Hier werden die photovernetzbaren Eigenschaften der Sphingosinsonde genutzt, um Lipid-Protein-Konjugate einzufangen und Proteine zu identifizieren, die an frühen Stadien des lysosomalen Sphingosintransports beteiligt sind. Diese interagierenden Proteine werden durch molekular- und zellbiologische Techniken weiter validiert und ihre Lipidtransporteigenschaften werden charakterisiert. Die vorgeschlagene Charakterisierung besteht in der Rekonstitution des Sphingosintransports in vitro mittels aufgereinigter Proteine und Liposomen, die eine photoaktivierbare und klickbare Sphingosinsonde enthalten. In silico Ansätze sowie Crosslinking-Massenspektrometrie werden angewendet, um die Sphingosinbindung und den Sphingosintransport auf detailliertere, mechanistische Weise aufzuklären. Die Entschlüsselung der molekularen Mechanismen des Sphingosineffluxes aus sauren Zellkompartimenten wird erheblich zu unserem Verständnis der zellulären Lipidhomöostase und ihrer Bedeutung für Gesundheit und Krankheit beitragen.

• DFG-Verfahren: WBP Stelle