Novel tetracycline inducible regulation systems for staphylococci
Final Report Abstract
Im Rahmen der Fördermaßnahme wurden neue molekulare Werkzeuge zur induzierbaren Genexpression und ortsspezifischen Rekombination entwickelt, die in erster Linie in Staphylokokken, aber auch in Bacillus subtilis eingesetzt werden konnten. Zunächst wurden DNA Sequenzen, die sich als geeignet zur Tetrazyklin (Tc)-induzierbaren Genexpression in B. subtilis erwiesen hatten, für S. aureus adaptiert und somit Plasmide und Stämme konstruiert, mit denen Reporter- und native S. aureus Gene auf effektive Weise artifiziell reguliert werden konnten. Hierzu wurde erstmals in Staphylokokken auf den reversen Tetrazyklinrepressor revTetR zurückgegriffen, mit welchem sich Zielgene schnell und reversibel herunterregulieren lassen. Entsprechende tet-Regulationskonstrukte waren auch in einer Studie zur Charakterisierung des TranskriptionsregulatorsYvoA/NagR von B. subtilis hilfreich. Von Transposons abgeleitete mobilisierbare genetische Sequenzen, die mit tet-regulierbaren Promotoren ausgestattet waren, wurden zur randomisierten Mutagenese von S. aureus eingesetzt. In einem weiteren Unterprojekt wurde ein 12-mer Peptid translational an ein rot-fluoreszierendes Reporterprotein (mCherry) fusioniert, welches somit befähigt war, TetR zu induzieren. Durch Umgehung der Tcbasierten Induktion von TetR konnte somit erreicht werden, dass die Produktion von mCherry mit der Aktivierung eines weiteren Reporters einherging, dessen Gen durch einen tet-sensitiven Promotor kontrolliert wurde. Schließlich wurden abgeschwächte Varianten des tet-sensitiven Promotors Pxyl/tet erzeugt, die stärkere Repressionsfähigkeiten und niedrigere Transkriptionsstärken als der Ausgangspromotor aufwiesen. Als weitere molekulargenetische Methode wurde Cre-lox Rekombination in Staphylokokken etabliert. Durch Flankierung von Antibiotikaresistenzmarkern war es möglich, diese nach Einbau in das Chromosom von Staphylokokken mittels der transient exprimierten Cre-Rekombinase wieder zu entfernen. Dies wurde anhand dreier genetisch manipulierter S. aureus und S. carnosus Stämme gezeigt. Die im Antrag angestrebten Zielstellungen sind somit weitestgehend erreicht worden.
Publications
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