Metabolische Markierung von RNA mithilfe synthetischer und bioorthogonal reaktiver Nucleoside als fluorogene Sonden in lebenden Zellen

• Antragsteller: Professor Dr. Hans-Achim Wagenknecht
• Fachliche Zuordnung: Biologische und Biomimetische Chemie
• Förderung: Förderung seit 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 461961063

Um biologische Prozesse der Nucleinsäuren, insbesondere der RNA, in ihrem natürlichen Umfeld, den lebenden Zellen untersuchen zu können, müssen sie mit Fluoreszenzsonden markiert werden. Für RNA wurde bereits die metabolische Markierung etabliert. Allerdings wurde die metabolische Markierung von RNA und DNA -unabhängig von den angewandten Reaktionstypen- in nahezu allen publizierten Arbeiten an fixierten Zellen, nicht in lebenden Zellen, durchgeführt. In diesem Projekt soll die metabolische Markierung der RNA mithilfe synthetischer und bioorthogonal reaktiver Nucleoside zu einem fluorogenen Werkzeug entwickelt werden, die in Kombination mit FISH-Sonden RNA-Transkripte in fixierten Zellen nicht nur als Schnappschuss visualisiert, sondern in lebenden Zellen beobachtbar macht. Die metabolisch markierte RNA fungiert als fluorogener Energiedonor, die FISH-Sonden als Energieakzeptor. Zur Anwendung kommen Diels-Alder-Reaktionen mit inversem Elektronenbedarf und „Photoclick“-Reaktionen, die sich nachweislich für die bioorganische, metabolische Markierung von RNA in lebenden Zellen eignen und daher in diesem Projekt als organisch-chemische Grundlage verwendet werden. Als bioorthogonal reaktive Gruppen haben sich die Cyclopropene als ausreichend reaktive und trotzdem ausreichend stabile funktionelle Gruppen herausgestellt und stehen im Fokus dieses Projektes. Cyclopropene sind nur etwas größer als die etablierten Vinylgruppen, lassen sich gut synthetisieren und sind daher für die metabolische Markierung geeignet. Anvisiert werden 1-Methylcyclopropene für die metabolischen Diels-Alder-Reaktionen und 3-Methylcyclopropene für die metabolischen „Photoclick“-Reaktionen. In-vitro-Experimente sollen die Reaktivität und Kinetik charakterisieren. Die metabolische Markierung in lebenden HeLa-Zellen soll durch RNA-Hydrolyse nachgewiesen werden. Die fluorogenen Eigenschaften in Kombination mit FISH sollen an ausgewählten mRNA-Transkripten und miRNA-Sequenzen evaluiert werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen