Funktionsanalyse des tRNA Bindeproteins Kti12

• Antragsteller: Professor Dr. Raffael Schaffrath
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung seit 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 450558823

In Eukaryonten ist die tRNA-Modifikation durch den Elongatorkomplex an der präzisen Dekodierung von mRNA während der Translation beteiligt. Um die Expression genetischer Information möglichst effizient zu realisieren, sollte man daher annehmen, der Modifikationskomplex sei permanent aktiv. Hinweise mehrerer AGs inklusive unserer eigenen, dass tRNA-Modifikationen unter manchen Bedingungen schwanken, und es akzessorische Interaktionspartner (Kti12; Kti14/Hrr25) gibt, suggerieren jedoch, dass die Elongatoraktivität eher regulierbar als konstitutiv vorliegt. Entsprechend wird der Elongator phosphoryliert durch Hrr25, und das Elongator-Partnerprotein Kti12 scheint dabei diese Kinase an den Modifikationskomplex zu rekrutieren.Wie gezeigt aus neuen Kristallisationsstudien und genetischen wie auch biochemischen Funktionsanalysen, gefördert auch durch die DFG, ist Kti12 strukturell sehr ähnlich der tRNA-Kinase PSTK, hydrolysiert ATP und bindet tRNAs mit niedrigerer Affinität als der Elongatorkomplex selbst. Wie die tRNA-Bindung von Kti12 im Wechselspiel mit seiner ATPase-Aktivität die Modifikation von tRNAs durch den Elongatorkomplex aktiviert und dessen Phosphoregulation durch Hrr25 beeinflusst, sind zentrale Aspekte, die in unserem Projektvorhaben folgendermaßen definiert und bearbeitet werden sollen:- Einfluss der tRNA-Bindung von Kti12 auf die Elongatoraktivität über Generierung von Kti12 Mutanten mit tRNA-Bindedefekt und Vermessung ihrer tRNA-Modifikationsprofile- Rolle der ATPase-Aktivität von Kti12 für die Interaktion mit Elongator anhand von Bindeassays zwischen Kti12 und Mutanten mit ATP-Hydrolysedefekt in Anwesenheit von ATP, ADP oder nicht–hydrolysierbarer Nukleotidanaloga- Analyse der Elongator aktivierenden Rolle von Kti12 und Hrr25 als Teil eines Proteinnetzwerks mittels Interaktions-, Phosphorylierungs- und tRNA-Modifikationsassays an Kti12 Mutanten mit Defekten in tRNA-Bindung oder ATPase-Aktivität- Identifizierung Elongator-unabhängiger Kti12 Interaktoren mittels MALDI-TOF-MS/MS nach Reinigung Elongator-freier Kti12 pools aus Mutanten mit tRNA-Binde- oder ATPase-DefektenDiese Vorgehensweise zielt darauf ab, Kti12 Struktur-/Funktionsbeziehungen zu erfassen, die die Interaktion mit Elongator und dessen Regulation zu klären ermöglichen. Da die Elongator-abhängigen tRNA-Modifikationen mit Neurodegeneration und Tumorbildung in menschlichen Zellen assoziiert sein können, kommt unserem Projektvorschlag auch biomedizinische Relevanz zu. Somit ist das Studium der Elongatorregulation durch das tRNA-Bindeprotein Kti12 nicht nur für die Translationskontrolle im Hefemodell bedeutsam, sondern auch dem Verständnis von Krankheitsentstehung bei höheren Eukaryonten in Antwort auf defizitärer tRNA-Modifikation zuträglich.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen