Evolutionäre Optimierung von Enzymen für ihre Funktion im C4 Photosynthese- Reaktionspfad: der Fall des NADP-Malatenzyms

• Antragstellerin: Professorin Dr. Veronica Maurino
• Fachliche Zuordnung: Pflanzenphysiologie ; Biochemie und Biophysik der Pflanzen
• Förderung: Förderung von 2020 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 441941117

Die Vorfahren von C4-Pflanzen entwickelten in ihrer Evolution eine biochemische Pumpe, die CO2 um Rubisco herum konzentriert, was zu einer höheren photosynthetischen Effizient führt. Die evolutionäre Adaptation zellulärer Aktivitäten an das C4-Syndrom basierte auf der molekularen Anpassung existierender Enzyme, in den meisten Fällen durch Genduplikationen gefolgt von Neofunktionalisierungen sowie Veränderungen in der Regulation und den biochemischen Eigenschaften der Genprodukte. Ein zentraler Schritt in der C4-Photosynthese ist die Erzeugung hoher CO2-Konzentrationen durch die Decarboxylierung einer C4-Säure in den Chloroplasten der Bündelscheidenzellen (BSZ). Die meisten agronomisch wichtigen C4-Pflanzen gehören zum NADP-Malatenzym (ME) Subtyp, welcher hauptsächlich NADP-ME für diesen Zweck verwendet. Während der Nacht, wird die enzymatische Aktivität durch zwei Prozesse reguliert: einerseits verliert das Enzym teilweise seinen aktiven quaternären Oligomerisierungszustand, andererseits wird es durch Malat gehemmt.Wir haben vor kurzem spezifische Aminosäuren identifiziert, die für die molekulare Anpassung von C4-NADP-ME wichtig sind. Dazu haben wir eine Analyse differenzieller Aminosäure-Konservierung mit der Aufklärung der Kristallstrukturen von C4-NADP-ME aus Mais und Sorghum und der biochemischen Analyse von Enzymmutanten kombiniert. Einige dieser Substitutionen sind höchstwahrscheinlich evolviert, um die notwendigen regulatorischen Anpassungen zu implementieren. In diesem Projekt wollen wir die molekularen Mechanismen aufklären, die der Entwicklung der beiden wichtigsten regulatorischen Eigenschaften des C4-NADP-ME zugrunde liegen, und diese regulatorischen Prozesse in vivo evaluieren. Wir konzentrieren uns auf die C4-Linie der Andropogoneae innerhalb der Panicoideae-Unterfamilie der Poaceae, zu der die C4-Gräser Mais und Sorghum gehören. Wir werden Kristallisationsanalysen mit in silico Modellierung kombinieren, um zu analysieren, wie spezifische Aminosäuren, die nur in C4-NADP-ME vorhanden sind, die strukturellen und kinetischen Eigenschaften des Enzyms beeinflussen. Durch die biochemische Analyse und Kleinwinkel-Röntgenstreuungsmessungen von N-terminalen Mutanten von NADP-ME werden wir bestimmen, welche anderen molekularen Anpassungen ebenfalls an der Änderung und Stabilisierung der verschiedenen oligomeren Zustände beteiligt sind. Wir werden den zugrundeliegenden molekularen Mechanismus der Malathemmung durch die biochemische Analyse spezifischer Enzymmutanten ermitteln. Darüber hinaus werden wir weitere Aminosäuren identifizieren, die an der Anpassung von C4-NADP-ME in den Andropogoneae beteiligt sind, indem wir weitere rekombinante NADP-ME-Mutanten herstellen und analysieren. Um diese regulatorischen Prozesse in vivo zu evaluieren, werden wir über die CRISPR-Cas9-Technologie Mutationen in das für C4-NADP-ME kodierende Gen einführen und phänotypische, biochemische und physiologische Analysen der erhaltenen Pflanzenlinien durchführen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen