Vitamin D induces a dynamic and celltype-specific modulation of the 3D- chromatin structure
Final Report Abstract
Anhand einer neuartigen hierarchischen bioinformatischen Analyse von VDR-Cistrom, -Transkriptom und FAIRE-seq-Daten konnten wir Vitamin D-Zielgene in primäre und sekundäre Targetgene einstufen. Es zeigte sich, dass von allen spät (24 h) 1,25(OH)2D3-regulierten Genen in monozytären Zellen immerhin 57.4% als primär klassifiziert wurden, was darauf hinweist, dass die übliche Einteilung rein nach Dauer der Stimulation zu einer starken Überschätzung der Anzahl an sekundären Targetgenen führt. Weiterhin zeigte ein VDR-Knockout, dass transkriptom-weite Effekte von 1,25(OH)2D3 komplett VDR-abhängig sind. Das Vorkommen und die Relevanz von nichtgenomischen VDR-abhängigen oder -unabhängigen Effekten wird seit vielen Jahren im Vitamin D-Feld kontrovers diskutiert. In monozytären Zellen können wir durch diese Studie jegliche VDR-unabhängigen Effekte des nukleären Hormons auf Genexpressionen ausschließen. Weiterhin konnten wir 47 Transkriptionsfaktoren identifizieren, welche in THP-1-Zellen laut unseren Vorhersagen sekundäre Effekte von 1,25(OH)2D3 vermitteln. Zwei von ihnen, ETS1 und CEBPA, konnten wir experimentell als sekundäre Transkriptionsfaktoren im Vitamin D-Signaling validieren. Dies führte zu einer Erweiterung des bis dato akzeptierten Modells der Vitamin D-Signalkaskade. Im Rahmen von Vorarbeiten für dieses Projekt etablierte CTCF-Knockout-Zellen zeigten zu Beginn ein normales Wachstum. Mit zunehmenden Passagezahlen jedoch, und besonders nach Isolierung von Einzelzellclonen durch Vereinzelung, war eine deutliche Wachstumsverzögerung zu sehen. Da zudem durch starke Varianzen zwischen den biologischen Replikaten kaum Effekte statistische Signifikanz zeigten, wurden die mit diesen Zellen geplanten RNA-seq-Assays stattdessen nach CTCF-Knockdown durchgeführt. Sowohl in unstimulierten als auch in 1,25(OH)2D3-behandelten Zellen wurde die Expression von ca. 600 Genen durch die CTCF-Depletion modifiziert. Die Schnittmenge hierbei betrug 321. Die für dieses Projekt generierten CTCF-HiChIP-Daten stellen den ersten genomweiten Datensatz CTCF-vermittelter Chromatin-Interaktionen in 1,25(OH)2D3-behandelten Zellen dar. VDR-Aktivierung bewirkte an 3,1% aller in THP-1-Zellen beobachteten CTCF-Interaktionen eine Veränderung der Häufigkeit dieser DNA-Schleifen. VDR-Assoziation war in diesen differentiellen Loops sowohl an den Anchors als auch im Inneren erhöht. Differentielle Schleifen wurden mit mehreren Funktionen in Verbindung gebracht, einschließlich der Bildung von TAD- Grenzen, Promotor-Enhancer-Interaktionen und der Etablierung von VDR-responsiven „insulated neighborhoods“. Auch Vitamin D-Zielgene waren in differentiellen Schleifen und an ihren Anchors angereichert. Die Bindung nachgeschalteter Transkriptionsfaktoren in Differentialschleifen weist auf einen Zusammenhang zwischen sekundären Vitamin D-Wirkungen und dynamischen Veränderungen von Chromatindomänen hin. CRISPR-Interferenz- und Loop-Anchor-Deletionsexperimente bestätigten die funktionelle Relevanz der von Liganden nukleärer Rezeptoren induzierten Anpassungen der Chromatin-3D-Struktur für die Genexpressionsregulation.
Publications
- A hierarchical regulatory network analysis of the vitamin D induced transcriptome reveals novel regulators and complete VDR dependency in monocytes. (2021) Scientific Reports 11 (1), 1-16
Warwick T., Schulz M.H., Günther S., Gilsbach R., Neme A., Carlberg C., Brandes R.P., Seuter S.
(See online at https://doi.org/10.1038/s41598-021-86032-5)
