RNA-Struktur-Analyse im Hochdurchsatzverfahren mittels spezifischer Ligation von cyclo-Phosphat-Enden und Deep Sequencing

• Antragsteller: Professor Dr. Mario Mörl; Professor Dr. Peter Florian Stadler
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 431361947

Wie Proteine falten sich auch RNA-Moleküle in vielfältige und komplexe Strukturen, um ihre Funktionen in der Zelle zu erfüllen. Während hochdefinierte Faltungen bei rRNAs, tRNAs, Ribozymen, Riboswitches und Terminatoren bereits lange bekannt sind, findet man zunehmend auch in mRNAs definierte Strukturen, die mit ihrer Stabilität, vor allem aber mit ihrer Translatierbarkeit korrelieren. Es ist somit von großem Interesse, die Strukturen aller Transkripte einer Zelle zu erfassen, um ihre Funktionsweise und Regulation besser zu verstehen. Während in vitro Strukturanalysen gut etabliert und relativ unkompliziert sind, ist die in vivo Analyse äußerst aufwändig. Gegenwärtig existieren nur wenige robuste Methoden, wie in cell SHAPE, DMS-Seq und deren Varianten SHAPE-MaP und DMS-MaPseq. Diese Ansätze basieren auf dem Auslesen von RT-Stopp Signalen bzw. von spezifischen Fehler-Signaturen, die während der RT entstehen. Nachteilig ist, dass RT-Stopps auch durch spontane Termination oder stabile RNA-Sekundärstrukturen entstehen bzw. dass nicht alle einzelstrangspezifischen Modifikationen zu RT-Signaturen führen. Wir wollen eine neuartige Methode etablieren, die über Ligationspositionen Einzelstrangbereiche ausliest. Die durch Blei-Spaltung entstandenen 2‘3‘-cyclo-Phosphat- und 5’OH-Enden werden mittels spezifischer Ligasen an Adapter fusioniert und im Deep Sequencing identifiziert. RT-basierte cDNA-Abbrüche werden nicht erfasst. Eine weitere Hintergrund-Reduktion wird durch die Analyse von Ligationsprodukten beider entstandenen RNA-Enden erreicht. Parallel zum experimentellen Vorgehen werden wir eine präzise bioinformatische Methode zur qualitativen und quantitativen Erfassung von Einzelstrang-Signalen entwickeln, um damit möglichst exakte RNA-Strukturen zu erhalten. Da eine direkte Messung der positions-weisen Struktur sehr hohe Coverage (ca. 10-15 Read-Enden pro Position) erfordert, werden wir Methoden entwickeln, die das gemessene Signal über kleine Intervalle aggregieren, sodass auch mit kleiner Coverage noch Aussagen getätigt werden können.Kombiniert mit Ribosome Profiling-Analysen wollen wir mit dieser neuen, orthogonalen Strategie dann in E. coli klären, wie mRNA-Strukturen und Translationseffizienz zusammenhängen – vor kurzem publizierte Untersuchungen zeigen hier stark gegensätzliche Ergebnisse. Zusätzlich wollen wir in psychrophilen Mikroorganismen analysieren, wie mRNA-Strukturen bei extrem niedrigen Temperaturen reguliert werden, um eine effiziente Translation zuzulassen.Insgesamt wollen wir eine neuartige Hoch-Durchsatz-RNA-Struktur-Analyse mit niedrigen Hintergrundsignalen entwickeln, um damit wichtige Fragen zum Einfluss von RNA-Strukturen auf Stabilität, Translationseffizienz und deren Regulation in verschiedenen Zellsystemen zu klären. Durch die Deponierung der Expressionsplasmide für die optimierten Ligasen in der nicht-kommerziellen Plasmid-Sammlung addgene wird diese Methode auch der wissenschaftlichen Gemeinschaft zugänglich gemacht.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen