Helligkeits- und kontrastverstärkte RNA-Hybridisierungssonden für mRNA Imaging und Erkennung lebender Zellen

• Antragsteller: Professor Dr. Oliver Seitz
• Fachliche Zuordnung: Biologische und Biomimetische Chemie
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 429038820

Mit fluorogenen Oligonucleotid-Hybridisierungssonden können spezifische RNA-Moleküle in lebenden Zellen nachge¬wiesen bzw. lokalisiert werden, ohne dabei die Zellen genetisch modifizieren zu müssen. Das Detektionslimit der derzeit verfügbaren Sonden reicht allerdings nicht aus, um RNA-Moleküle abzubilden/nachzuweisen, die in mittlerer geschweige denn niedriger Kopienzahl exprimiert werden. Das Ziel dieses Vorhabens ist es, diese Methodenlücke zu schließen. Hierzu werden RNA-Hybridisierungssonden (RNA-FIT-Sonden) entwickelt, die i) den Übergang vom ungebundenen zum Target-gebundenen Zustand durch eine sehr starke Intensivierung der Fluoreszenz anzeigen, ii) eine hohe Helligkeit der Fluoreszenzsignale liefern und iii) durch Einbeziehung eines zusätzlichen Detektionskanals die Möglichkeit eröffnen, die gemessenen Fluoreszenzsignale um die lokale Konzentration der Sonde zu korrigieren. RNA-FIT-Sonden enthalten ein Basensurrogat, das die Hybridisierung der Sonde durch verstärkte Fluoreszenzemission anzeigt. In diesem Vorhaben werden wir neue fluoreszente Basensurrogate entwickeln, die durch gezielte Aminomodifizierungen Steigerungen der Fluoreszenzquantenausbeute erfahren. Multifluorophor-FIT-Sonden werden es ermöglichen, sowohl die Helligkeit als auch das Ansprechverhalten bei Hybridisierung zu erhöhen. Entscheidend ist hierbei, Homo-FRET zu minimieren. Über Click-Konjugation am Basensurrogat werden lichtsammelnde Hilfsfarbstoffe angebracht, die über Energietransfer die Helligkeit weiter erhöhen. Ein nicht-responsiver Farbstoff, der vom Energietransfer ausgeschlossen bleibt, dient als Reporter der lokalen Konzentration.Für viele Bereiche der Zellbiologie wäre es sinnvoll, wenn es gelänge, spezifische Transkripte in genetisch nicht modifizierten Zellen zu erkennen und für die Zellsortierung z.B. über Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) zu nutzen, um die selektierten Zellen in weitergehenden Arbeiten zu expandieren. Beispielhaft werden wir die kontrast- und helligkeitsverstärkten RNA-FIT-Sonden gegen die mRNA für die CDR3-Region des T-Zellrezeptors (TCR) richten und durch Mikroporation oder amphiphile Blockkopolymere in gut charakterisierte T-Zelllinien einbringen. Fluoreszenzmikroskopischen und durchflußzytometrische Messungen werden die Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen verschiedenen T-Zelllinien belegen. Die CDR3-Region bestimmt, ob T-Zellen Krebsgewebe erkennen oder nicht. Fernziel ist es, zu ergründen, ob krebsreaktive T-Zell-Klone, die durch Sequenzierverfahren identifiziert wurden, mittels FACS selektiert werden können.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen