Charakterisierung der schrittweisen Assemblierung und Integration des [FeFe]-Hydrogenasen H-Clusters

• Antragsteller: Professor Dr. Thomas Happe
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 428051509

In der lebenden Zelle benötigt die Herstellung komplexer FeS Cluster meist eine vergleichsweise große Anzahl an Helferproteinen (Maturasen), welche die schrittweise und koordinierte Assemblierung des Cofaktors ermöglichen. Im Falle des Cofaktors von [FeFe]-Hydrogenasen (H-Cluster:[4Fe4S]-Cys-[2Fe2S](CO)3(CN-)2(CH2)2NH) besteht das zugehörige Maturationssystem des einzigartigen [2Fe2S]-Subclusters (2FeH) aus lediglich drei Enzymen. Die Radikal-SAM Enzyme HydE und HydG stellen einzelne Untereinheiten (Synthons), einschließlich der ungewöhnlichen Ligandenumgebung der Fe-Ionen bereit. Die GTPase HydF ist ein Gerüstprotein, welches die geeignete Umgebung für die Assemblierung des 2FeH-Vorläufers (p2FeH) zur Verfügung stellt und durch spezifische, aufeinanderfolgende Interaktionen mit HydE und HydG die Reihenfolge der einzelnen Schritte bestimmt. Während viele Aspekte der Synthon-Synthese durch HydG bereits aufgeklärt sind, sind die Details der p2FeH-Herstellung auf HydF sowie der Integration des Subclusters in das unmaturierte [FeFe]-Hydrogenaseprotein noch weitgehend unbekannt. Diese sind jedoch wichtig, um den Maturationsprozess in seiner Gesamtheit verstehen zu können. Unbekannte sind etwa die genaue Reihenfolge der Assemblierungsschritte auf HydF, die Charakteristika der entsprechenden p2FeH-Intermediate sowie die Koordination der Synthons durch HydF. Weiterhin ist weitgehend unbekannt, welche Schritte zur finalen Integration von p2FeH in das aktive Zentrum des [FeFe]-Hydrogenaseproteins führen, nachdem das Subcluster übertragen wurde. Diesbezüglich haben wir im Rahmen einer großangelegten Variantenstudie bereits kinetische, IR-spektroskopische und elektrochemische Daten erhalten, die auf die wichtige Rolle einzelner basischer Reste für die 2FeH-Einbindung hinweisen. Weiterhin scheinen fünf Glycinreste als "Scharnierpositionen" im Umfaltungsprozess zu fungieren, welcher die Schließung der H-Cluster-Nische nach Einbau der 2FeH-Untereinheit erlaubt. Hier wollen wir diese Daten durch strukturelle Charakterisierung der einzelnen Varianten komplementieren. Um Schritte der p2FeH-Subcluster-Assemblierung auf HydF zu verstehen, werden wir zunächst das strukturell aufgeklärte HydF von Thermosipho melanesiensis spektroskopisch und durch Variantenstudien im Detail untersuchen. Interessanterweise liegt HydF in der einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii als Fusion mit dem HydE-Protein vor. Um Besonderheiten dieser Fusion zu verstehen, werden wir HydEF heterolog herstellen und kristallisieren. Weiterhin werden wir die Assemblierung von p2FeH in der HydF-Domäne charakterisieren und mit der in T. melanesiensis HydF vergleichen. Die identifizierten Gemeinsamkeiten und Unterschiede werden zur Aufklärung der zellulären Reifung von [FeFe]-Hydrogenasen beitragen.

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 1927: Iron-Sulfur for Life