21-Hydroxpregnan-21-O-Malonyltransferasen: Heterologe Expression in Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae, Charakterisierung und Bedeutung für die Cardenolid-Biosynthese

• Antragsteller: Professor Dr. Wolfgang Kreis
• Fachliche Zuordnung: Pflanzenphysiologie
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 427204405

Cardenolide, wie Digoxin, werden immer noch durch Extraktion aus getrockneten Blättern von Digitalis lanata gewonnen. Eine strukturelle Besonderheit der Cardenolide ist ihr Gamma-Lakton-Ring (Butenolidring), der an C-17 des Steroid-Grundgerüst angefügt ist. Man nimmt an, dass der Aufbau des Butenolidrings durch die Bildung von 21-O-Malonyl-5ß-pregnan-3ß,14ß-diol-20-one eingeleitet wird. Dieser Schritt wird von einer Malonylcoenzym A:21-Hydroxypregnan-21-O-malonyltransferase (21MaT) katalysiert, einem Enzym, das den Malonylrest von Malonyl-CoA auf die 21-Hydroxygruppe geeigneter Pregnan-Vorstufen überträgt. Die eigentliche Butenolidring-Bildung kann in vitro spontan erfolgen; dabei wird der Pregnan-21-O-Hemiester ohne Enzymbeteiligung unter Ringbildung decarboxyliert und dehydriert. Verschiedene Anläufe 21MaTs aus cardenolid-produzierenden Pflanzen zu isolieren, resultierten in der (Teil-)Reinigung unterschiedlicher MaTs. Versuche diese Proteine zu sequenzieren, waren bisher nicht erfolgreich. In Arabidopsis thaliana wurde mit AtPMaT1 ein erstes Kandidaten-Gen identifiziert, das ein Enzym enkodiert, das fähig ist 21-Hydroxpregnane zu malonylieren. Für eine rekombinante Form (rAtPMaT) wurde bereits nachgewiesen, dass es 5ß-Pregnan-14ß,21-diol-20-one zu malonylieren vermag und so 21-O-malonyl-5ß-pregnane-14ß-ol-20-on, die direkte Vorstufe des Digoxigenins, bereit stellt. Ein homologes Gen konnte auch in Digitalis lanata identifiziert, kloniert und funktionell in E. coli exprimiert werden. Weitere Kandidatengene kónnten identifiziert werden. Diese Gene sollen in E.coli exprimiert und charakterisiert und mit jenem aus A. thaliana verglichen werden. Durch Expression einer geeigneten 21MaT auch in Saccharomyces cerevisiae soll eine bereits existierende biotechnologische Plattform zur Herstellung von Cardenoliden weiter ausgebaut werden. Wir nehmen an, dass die 21-O-Malonylierung einen zentralen Schritt der Cardenolidbildung darstellt, weil hierdurch - wie im Metabolismus bestimmter Xenobiotika - eine Substanz gebildet wird, die möglicherweise aktiv über den Tonoplasten in die Vakuole, einem Speicherort für Cardenolide, transportiert werden kann. Die Isolierung und Charakterisierung von 21MaT-Enzymen und -Genen wird es uns ermöglichen, den Stoffwechsel 21-O-malonylierter Pregnane und deren Bedeutung für die Cardenolid-Biosynthese besser zu verstehen, um schließlich eine Cardenolid-Biosynthese in der Hefe realisieren zu können.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Mitverantwortlich(e): Dr. Jennifer Munkert