Enzymatische PCR-Replikation von vollständig orthogonalen Nukleinsäuren als synthetische Modellgenome

• Antragsteller: Dr. Damian Ploschik
• Fachliche Zuordnung: Biologische und Biomimetische Chemie ; Organische Molekülchemie - Synthese, Charakterisierung
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 421699074

Die detaillierte Untersuchung biologischer Systeme stellt eine der wichtigsten Aufgaben dar, die für wissenschaftliche Gebiete wie der Medizin, Biologie, Teilen der Chemie und deren jeweilige Überschneidungsbereiche von großem Interesse ist. Durch das Einschleusen unnatürlicher und metabolisch stabiler Nukleinsäuren können zusätzliche genetische Informationen in den zu untersuchenden Mikroorganismus oder die Zelle übertragen werden. Diese Manipulation erlaubt ein genaueres Verständnis der zellulären Vorgänge und stellt die zentrale Aufgabenstellung der synthetischen Biologie dar, welche versucht ein biologisches System künstlich herzustellen und gezielt zu designen. Im Rahmen dieses Projekts sollen zwei artifizielle Nukleotid-Basenpaare synthetisiert werden, deren Paarung auf einem, im Vergleich zum natürlichen Watson-Crick-Modell, alternativen Wasserstoffbrücken-Muster beruht. Um die hydrolytische und metabolische Stabilität der Nukleotide zu gewährleisten, sollen diese als sogenannte C-Nukleoside aufgebaut werden, bei denen die nukleosidische Bindung über ein Kohlenstoffatom der Nukleobase erfolgt. Ziel ist es, komplette DNA-Abschnitte aus diesen Bausteinen aufzubauen und in vivo mittels Replikation zu vermehren. Hierzu sollen zunächst geeignete Enzyme (DNA-Polymerasen, reverse Transkriptasen) gefunden werden, welche die künstlichen Nukleinsäure-Bausteine erkennen und effizient zur enzymatischen DNA-Synthese verwenden können. Diese Methode soll sowohl an kurzen Oligonukleotiden (20 bis 30 Basenpaare), als auch an längeren DNA-Sequenzen (500 – 200 bp) angewandt werden. Hierbei soll zusätzlich die Vervielfältigung der artifiziellen DNA mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) gezeigt werden. Zuletzt sollen die oben beschriebenen, unnatürlichen DNA-Abschnitte mit Hilfe von Enzymen in Plasmide kloniert und diese in Mikroorganismen, wie beispielsweise E. coli transformiert werden. Dadurch soll gezeigt werden, dass die unnatürlichen Nukleotide ebenfalls in vivo eine stabile Basenerkennung ausbilden und die entsprechenden DNA-Stränge mittels zellulärer Replikation vermehrt werden können. Mit Hilfe dieser Experimente sollen die synthetisierten Nukleoside in Zukunft zum Kodieren von genetischen Informationen genutzt werden. Diese können dazu dienen um Mikroorganismen mit vollsynthetischen, orthogonalen Genomen und dadurch mit neuen und zusätzlichen Eigenschaften auszurüsten, wodurch eine Vielzahl an neuen Anwendungen (z.B.: Expression von nicht-natürlichen Enzymen zur Katalyse nützliche Reaktionen) möglich wird.

• DFG-Verfahren: Forschungsstipendien
• Internationaler Bezug: Belgien
• Gastgeber: Professor Dr. Piet Herdewijn