MK2/3-abhängige Mechanismen der durch RIPK1-Phosphorylierung gesteuerten Regulation von Entzündung und Zelltod

• Antragsteller: Professor Dr. Matthias Gaestel, seit 5/2019
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie ; Biochemie
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 405953283

Die TNF-Rezeptor interagierende Proteinkinase RIPK1 stellt einen zentralen Schalter des Zellverhaltens bei Infektion und Entzündung dar. Insbesondere bestimmen komplexe post-transkriptionelle Proteinmodifikationen (PTMs) von RIPK1 die Zellantwort auf TNF-Stimulation und auf die Erkennung von Pathogen-assoziierten molekularen Mustern wie Lipopolysaccharid (LPS). Kürzlich gelang uns der Nachweis des Wechselspiels zwischen dem Stress- und Zytokin-aktivierten p38 MAPK-MK2/3-Weg und dem RIPK1-Signaling. Die p38MAPK-aktivierte Proteinkinase MK2 phosphoryliert RIPK1 direkt und unterdrückt damit die Aktivierung von RIPK1, ihre Autophosphorylierung und ihren Einbau in zytosolische, Zelltod-induzierende Proteinkomplexe. In Übereinstimmung mit der inhibitorischen Rolle der MK2 für RIPK1 wurde beobachtet, dass smac-mimetics (SM)-induzierte TNF-Produktion und nachfolgender Zelltod leukämischer Zellen durch p38MAPK/MK2-Hemmer verstärkt werden konnte. Im beantragten Projekt wollen wir die Mechanismen der MK2-abhängigen Regulation der RIPK1-Funktion bei Zelltod und Entzündung weiter untersuchen. Dazu sollen MK2-abhängige Veränderungen der PTMs, der Kinaseaktivität, der subzellulären Lokalisation, der Oligomerisierung, und der Wechselwirkungspartner von RIPK1 in MK2/3-defizienten Fibroblasten und Makrophagen und Kontrollzellen analysiert werden. Das soll mittels Phosphorylierungsort- und Modifikations-spezifischen Antikörpern sowie mit Kandidatenprotein- und erkundender LC-MS/MS-basierten Ansätze erfolgen. Darüber hinaus werden mittels der CRISPR/Cas9 knock-in-Methode Zelllinien generiert, die Mutationen in den Phosphorylierungs/Ubiquitinierung-Orten von RIPK1 besitzen. Diese Zelllinien sollen dann auf Veränderungen im TNF/LPS-Signaling untersucht werden. Während MK2 essentiell für die RIPK1-unabhängige Biosynthese von TNF ist, stellt sich MK2 aber auch als negativer Regulator der RIPK1-abhängigen, SM-induzierten TNF- und Zytokinproduktion dar. Die Stimulus-abhängige, scheinbar gegensätzliche Funktion von MK2 bei der Zytokinbiosynthese soll durch vergleichende Analyse von primären und immortalisierten Macrophagen weiter untersucht werden. Die oben ermittelten PTMs und Wechselwirkungspartner sollen dabei genutzt werden, um Zelltyp- und Stimulus-abhängiges MK2-RIPK1-Signaling besser zu verstehen. Aufgrund seiner essentiellen Rolle für die TNF-Biosynthese gilt MK2 bisher als ein vielversprechendes Zielmolekül für die anti-inflammatorische Therapie. Das Verständnis der neuen, RIPK1-abhängigen Funktion von MK2 wird wesentlich für den Erfolg entsprechender therapeutischer Ansätze sein. Darüber hinaus könnte das Verständnis der Rolle von MK2/RIPK1 bei der SM-induzierten TNF-Produktion zur Vermeidung einer SM-Resistenz bei der Tumortherapie genutzt werden. Das Projekt kann sowohl neue Erkenntnisse über grundlegende Mechanismen des kontrollierten Zelltodes liefern, als auch neue, relevante Informationen für die Therapie von Entzündung und Krebserkrankungen generieren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Ehemaliger Antragsteller: Privatdozent Dr. Manoj Balakrishna Menon, bis 4/2019