Strukturen des ON und OFF Zustandes der membranständigen Sensorkinasen DcuS von E. coli und CitA von Geobacillus thermodenitrificans

• Antragsteller: Professor Dr. Christian Griesinger; Professor Dr. Dariush Hinderberger; Professor Dr. Gottfried Unden
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 396465415

Sensorkinasen (SK) stellen in Bakterien eine wichtige Klasse von Sensoren zur Perzeption extrazellulärer Reize dar. Die SK zeigen in Domänenaufbau und dem Signaltransfers über die Membran eine große Vielfalt. Essentieller Bestandteil ihrer Funktion ist immer die Perzeption des Reizes, der Signaltransfer über die Membran, und die Signalkonversion im Cytoplasma zur Kontrolle der Kinasedomäne. DcuS und CitA repräsentieren eine weit verbreitete Klasse von SK, die Fumarat oder Citrat als Effektor erkennen und die Expression von Genen des Fumarat- oder Citrat-Stoffwechsels kontrollieren. Ziel des Antrags ist die Charakterisierung der Struktur von DcuS/CitA im ON und OFF-Zustand, um die Strukturänderungen zu verstehen, die für Signaltransfer und Konversion verantwortlich sind. Struktur und Funktion des Nitratsensors NarQ wurde kürzlich in einer GAF-Kinase-Domänen defizientenForm beschrieben. NarQ zeigt einen Domänenaufbau, der sich weitgehend von DcuS/CitA unterscheidet und vermutlich eine andere Art der Reizerkennung und Verarbeitung repräsentiert.DcuS von E. coli und das nahe verwandte CitA des thermophilen Geobacillus thermodenitrificans sind aus einer extra-cytoplasmatischen PASP (Per ARNT Sim) Domäne zur Bindung von Fumarat oder Citrat, zwei Transmembran(TM)-Helices (TM1, TM2), einer cytoplasmatischen PASC und der Kinasedomäne aufgebaut. Die Untersuchungen sollen mit DcuS und CitA komplementär durchgeführt werden, weil beide Proteine nicht in gleicher Form für alle Methoden zugänglich sind. Die Strukturen von PASP und PASC wurden in isolierter und in membranintegraler Form im ON und OFF Zustand bestimmt. Strukturelle und biochemische Studien zeigen eine Kompaktierung von PASP nach Substratbindung. Diese treibt eine Kolbenhubbewegung von TM2 und den Signaltransfer über die Membran. Die Hubbewegung verursacht in PASC eine Umstrukturierung, die die Aktivität der Kinasedomäne steuert.Das Projekt soll, ausgehend von den strukturellen und biochemischen Vorarbeiten, eine hochaufgelöste und integrierte Darstellung der strukturellen Änderungen von DcuS/CitA beim Übergang vom OFF in den ON-Zustand liefern. Die Arbeit konzentriert sich auf die strukturellen Änderungen von DcuS/CitA in der Membran (Kolbenhub von TM2, vermutlich kombiniert mit Scherenbewegung), und der Umstrukturierung von PASC während des Signaltransfers von der Membran zur Kinasedomäne, inklusive der resultierenden Aktivitätskontrolle. Zur Charakterisierung der Struktur- und Funktionsänderungen werden strukturelle (Kristallisation, NMR; AG Griesinger), biochemische, genetische (AG Unden)und biophysikalische Ansätze(AG Hinderberger, Griesinger) verfolgt. Die genetischen und Protein-Konstrukte sind vorhanden, die Methoden sind etabliert. Wir erwarten, dass für DcuS und CitA eine genaue Analyse der Funktion, inklusive des transmembranen und cytoplasmatischen Signaltransfers, in hoher struktureller und funktioneller Auflösung in Reichweite ist.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen