Entwicklung antagonistischer Varianten von Thymic Stromal Lymphopoietin (TSLP) und Evaluierung ihrer Inhibition Asthma-assoziierter TSLP-Aktivität durch von ex vivo-Studien an humanen Leukozyten
Rheumatologie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Thymic Stromal Lymphopoietin (TSLP) ist ein Zytokin, dem eine zentrale Rolle bei Auslösung und Aufrechterhaltung von Asthma bronchiale und auch bei der Pathogenese bestimmter B-Zell Leukämien zugeschrieben wird. In diesem Projekt sollten Proteine mit inhibitorischen Eigenschaften bzgl. der Aktivierung des humanen TSLP-Rezeptors (hTSLPR) generiert und charakterisiert werden. Zudem wurde ein besseres Verständnis des Aktivierungsmechanismus des hTSLP-Rezeptors angestrebt. Ein vielseitig einsetzbares zelluläres Modellsystem konnte auf der Basis der faktorabhängigen murinen B-Zelllinie Ba/F3 weiterentwickelt werden, das die strukturelle und funktionelle Charakterisierung des TSLPR-Komplexes als auch vieler anderer ligandendimerisierter Rezeptorsysteme rationalisiert. Auf der Basis struktureller Daten wurde eine Vielzahl von hTSLP-Varianten erzeugt mit dem Ziel, Derivate mit verringerter Affinität für die hlL-7Ra-Kette bei erhaltener Affinität für die hTSLPRa-Kette zu identifizieren, und auf diese Weise potentiell antagonistische Agenzien bzgl. der hTSLP-abhängigen Rezeptoraktivierung zu gewinnen. Die hTSLP-Varianten wurden bzgl. ihrer Bindung and die Rezeptorketten und bzgl. ihrer Potenz, den Rezeptor in Reporterzellen zu stimulieren und das wildtypische Zytokin zu verdrängen charakterisiert und kategorisiert. Es gelang durch dieses Vorgehen, partielle, aber keine hocheffizienten Antagonisten zu erhalten. Weitere Zugriffe zur Gewinnung potentiell inhibitorischer Proteine bestanden in der Erzeugung von bakteriell exprimierten Fusionsproteinen, die individuelle Helices des hTSLP-Proteins enthielten sowie von ligandenbindenden löslichen Rezeptordomänen. Die besten dosisabhängigen antagonistischen Effekte wurden mit einer Kombination der extrazellulären Domänen von hTSLPRα und hlL-7Rα erzielt. Weiterhin sind in einem Vorläuferprojekt generierte monoklonale Antikörper ausführlich bzgl. ihrer Fähigkeit, hTSLP-induzierte Signalauslösung zu hemmen studiert worden. Im Zuge dieser Arbeiten entstand der interessante Befund, dass der gegen hTSLPRa gerichtete Mab WBA9 in der Lage ist. präferentiell eine mutierte Variante zu blockieren, die in ligandenunabhängiger Weise zur Malignität einer bestimmten Form von B Zell-Leukämie beiträgt. Dieser Antikörper wurde in rekombinanter Form hergestellt und wird derzeit auf sein Potential als Leitstruktur für die Entwicklung von neuen Therapeutika gegen B Zell-ALL untersucht. Weitere Untersuchungen galten dem Aktivierungsmechanismus des hTSLPR-Komplexes. Rekonstitutionsexperimente und Bindungsstudien mit rekombinanten Rezeptordomänen bestätigten die konsekutive Ausbildung einer tripartiten Assoziation von hTSLP mit den beiden Komponenten des Rezeptor-Heterodimers und erlaubten den weitestgehende Ausschluss einer Beteiligung von zusätzlichen Rezeptorketten und des Einflusses von Proteinglycosylierungen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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A versatile platform for activity determination of cytokines and growth factors based on the human TSLP (thymic stromal lymphopoietin) receptor. Cytokine 113: 228-237 (2019)
Marković I, Barthel T, Schirmer M, Gonzälez Delgado A, Wilhelm S, Krause S, Friedrich K, Wohlmann A
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FACS-Based Functional Protein Screening via Microfluidic Co-encapsulation of Yeast Secretor and Mammalian Reporter Cells. Sci Rep. 23: 10182 (2020)
Yanakieva D, Elter A, Bratsch J, Friedrich K, Becker S, Kolmar H
