New non-chromatographic affinity matrices for antibody purification
Final Report Abstract
Antikörper haben den größten Marktanteil unter den biotechnologischen Produkten. Bei deren Produktionskette stellt das downstream processing das Nadelöhr dar. Lange Prozesszeiten während der Protein A-Chromatographie beschränken die Produktivität. In diesem Projekt wurden sowohl alternative stationäre Phasen für die Immobilisierung von Protein A als auch Designstrategien für die Antikörper-bindenden Liganden untersucht. Als Protein- Designstrategie wurde die Einführung von verlängerten Interdomänenlinkern gewählt. Auf Seiten der neuen Materialen wurde der Fokus auf nicht-poröse, magnetische Eisenoxidnanopartikel (BION) gelegt, um die langsame Porendiffusion des Antikörpers im Material zu umgehen. Ein aus Vorarbeiten optimierter Ligand, bestehend aus acht polymerisierten B-Domänen (B8) des rekombinanten Protein A-Moleküls, wurde für die Immobilisierung ausgewählt. Als besonders vielversprechend hat sich eine besondere Strategie herauskristallisiert: Die Immobilisierung über einen Affinitäts-Peptidtag für Eisenoxidoberflächen bestehend aus einer sich viermal wiederholenden Sequenz von Arginin- Histidin ((RH)4). Über eine Kombination aus komplexierenden und elektrostatischen Wechselwirkungen wurde der Ligand B8-(RH)4 an kostengünstige, unmodifizierte BION gebunden. Aufwendige und teure Materialaktivierungen entfallen dadurch. Das Fourier- Transformations-Infrarotspektrogramm zeigte die erfolgreiche Immobilisierung. Die Ligandendichte konnte mittels Bicinchoninsäure-Assay direkt auf dem Material quantifiziert werden und betrug etwa 40 mg pro g BION. Mittels dieser BION@B8-(RH)4 Partikel konnten humane, polyklonale Antikörper magnetisch separiert werden. Dieses neuartige Affinitätsmaterial erlaubte eine selektive Antikörper-Rückgewinnung von bis zu 418 mg g-1, was den bisherigen Stand der Technik überschreitet. Auch die Separation von monoklonalen Antikörpern wurde untersucht. Mittels Größenausschlusschromatographie konnte gezeigt werden, dass in der Elutionsfraktion bis zu 88% Monomere vorhanden sind. Die BION ohne immobilisierte Liganden sind für bestimmte Seitenketten von Proteinen reaktiv und können dadurch auch unspezifisch Proteine binden. Allerdings konnte allein durch die Anwesenheit des großen B8-(RH)4 Liganden (56 kDa) eine verminderte unspezifische Bindung von Proteinen nachgewiesen werden, wodurch das Fouling des Materials verringert wird. Die Anwendung dieser BION@B8-(RH)4 konnte erfolgreich als Patent angemeldet werden und erlaubt aufgrund ihrer hohen Effizienz ein großes wirtschaftliches Interesse. Weiterhin konnte auch eine erfolgreiche Immobilisierung eines B8-Liganden mit C-terminalem Cystein (B8-cys) über eine kovalente Kopplung an reaktive Epoxygruppen demonstriert werden. Hierbei wurden die BION durch (3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilan (GPTMS) aktiviert. Diese BION@GPTMS@B8-cys Partikel lieferten mit bis zu 220 mg g-1 ebenfalls eine hohe Rückgewinnung an polyklonalen Antikörpern mittels magnetischer Separation. In diesem Projekt wurden erfolgreich neuartige Affinitätsmaterialien durch die Kombination von optimierten, hochgradig polymerisierten Domänen des Protein A mit magnetischen Nanopartikeln geschaffen, die eine effiziente magnetische Separation von Antikörpern ermöglichen. Bisherige Versuche fanden im Labormaßstab statt. Die Arbeiten bieten eine Grundlage, den Prozess in Zukunft in einem Hochgradienten-Magnetabscheider in den technischen Maßstab zu übertragen.
Publications
- Novel Peptide Tag (EP20185909.7)
S. Berensmeier, S. P. Schwaminger, S. A. Blank-Shim, P. Fraga García, Y. Kaveh-Baghbaderani, A. Zanker, S. Rauwolf, W. Wenzel
- Magnetic Separation of Antibodies with High Binding Capacity by Site- Directed Immobilization of Protein A-Domains to Bare Iron Oxide Nanoparticles; ACS Appl. Nano Mater. 2021, 4, 5, 4956–4963
Y. Kaveh-Baghbaderani, R. Allgayer, S. P. Schwaminger, P. Fraga-García, and S. Berensmeier
(See online at https://doi.org/10.1021/acsanm.1c00487)
