Directed evolution of a tryptophan synthase alpha-subunit to engineer a C-C bond-forming enzyme for organic synthesis
Final Report Abstract
Ziel meines Forschungsstipendiums in der Arbeitsgruppe von Prof. Arnold war es, die Tryptophan-Synthase TrpS mit Hilfe der gerichteten Evolution als Biokatalysator für neue, stereoselektive C-C-Bindungsreaktionen zu entwickeln. Dabei war meine Ursprungsidee, die α- Untereinheit des Enzyms zu verwenden. Dessen biologische Reaktion ist eine Retro- Aldolreaktion zur Spaltung von Indol-D-Glycerinaldehyd-3-Phosphat zu Glyerinaldehyd-3- Phosphat und Indol. Das Ziel, dieses Enzym in Aldolrichtung für nicht-phosphorylierte Substrate zu verändern, konnte nicht erreicht werden, da trotz zahlreicher Optimierungsversuche die Retro- Aldolreaktion weiterhin bevorzugt stattfand und selbst durch das Screening größerer Mutationsbibliotheken der Umsatz für das nicht-phosporylierte Substrat nicht verbessert werden konnte. Daher wurde die Projektidee auf die β-Untereinheit der Tryptophan-Synthase (TrpB) übertragen. TrpB katalysiert in der Natur die Kondensationsreaktion von L-Serin und Indol zu L-Tryptophan und konnte bereits in der Arbeitsgruppe von Prof. Arnold als neue Plattform für die biokatalytische Synthese von Tryptophan-Analoga etabliert werden. Ziel dieses Projektes war es, das Enzym so zu verändern, dass es 3-substituierte Oxindole als neue Substratklasse akzeptiert, um so die stereoselektive Synthese von nicht-natürlichen Aminosäuren mit einem quartären Kohlenstoffzentrum zu ermöglichen. Da die ursprünglichen TrpB Varianten nicht die gewünschte C-C-Bindung eingingen, sondern stattdessen das NH-Stickstoffatom des Oxindols als Nukleophil nutzten, wurde das N1-Atom des 3-Methyloxindols chemisch geschützt. So konnte die gewünschte C-C-Bindungsknüpfung erzielt werden. Die initiale, geringe Aktivität von ca. 2 TTN (Total Turnover Number) konnte über sechs Generationen gerichteter Evolution um das 400-Fache gesteigert werden. Dabei war schon nach der ersten Generation die Stickstoff-Schutzgruppe nicht mehr erforderlich, da die Chemoselektivität des Enzyms vom N- zum C-Alkylierungsprodukt erfolgreich geändert wurde. Die finale Variante TrpB Pfquat ist somit in der Lage, Oxindol-basierte, nicht-natürliche Aminosäuren herzustellen und dabei ein neues, quartäres Kohlenstoffzentrum selektiv an der γ-Position des Produktes einzufügen. Das Substratspektrum der Oxindole reicht dabei von substituierten Oxindolen am aromatischen System, über längere Alkylketten an der 3-Position bis hin zu 3- Hydroxyoxindol. Des Weiteren ist das Enzym nicht auf Oxindole als Nukleophile beschränkt, sondern kann auch strukturell vergleichbare Laktone und Ketone umsetzen. Letztere sind besonders interessante Verbindungen, da Ketone mit einer quartären Kohlenstoffgruppe an der 1-Position ein häufig vorkommendes Strukturmotiv sind und bisher kein Enzym bekannt war, welches dieses Produkt durch die Alkylierung der tertiären Ketone herstellen kann. Interessant ist auch, dass Pfquat neben der Chemo- und Regioselektivität eine sehr hohe Regioselektivität aufweist; An dem tertiären Keton wird von Pfquat nämlich ausschließlich die tertiäre Alkylgruppe funktionalisiert, während die sekundäre Alkylgruppe nicht reagiert. Um die Konfiguration des neuen, quartären Stereozentrums der Produkte zu bestimmen, wurde in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Gonen aus der University of California, Los Angeles die Kristallstruktur zweier Produkte über sog. MicroED (microcrystal electron diffraction) gelöst. Da die finale Variante aus diesem Projekt neben den oben beschriebenen katalytischen Eigenschaften eine hohe Thermostabilität (> 75°C) und eine exzellente Expressionsrate in E. coli (> 500 mg Protein / 1 L Expressionskultur) aufweist, bin ich davon überzeugt, dass es eine effektive und nachhaltige Plattform zur Herstellung nicht-natürlicher Aminosäuren mit quartären Kohlenstoffzentren darstellt.
Publications
- J. Am. Chem. Soc. 2019, 141, 50, 19817-19822: „Tailoring TrpB for selective quaternary carbon bond formation“
M. Dick, N. S. Sarai, M. W. Martynowycz, T. Gonen, F. H. Arnold
(See online at https://doi.org/10.1021/jacs.9b09864)
