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Projekt
Ribosomenprofiling und Bioinformatik
Antragstellerinnen / Antragsteller
Professor Dr. Rolf Backofen; Professorin Dr. Cynthia Mira Sharma
Fachliche Zuordnung
Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
Förderung
Förderung seit 2017
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 384562025
Ribosome profiling (Ribo-seq) ist ein leistungsstarkes Verfahren, was auf RNA-seq von ribosomalen „footprints“ auf Boten-RNA basiert, mit dem Ziel, sowohl dynamische Veränderungen des Translatoms zu analysieren alsauch offene Leserahmen (ORF) einschließlich derer kleiner Proteine mit weniger als 70 aa genomweit zu identifizieren. Im zentralen Projekt Z2 stellen wir eine Plattform für Ribo-seq und Bioinformatik-Support zur Identifizierung und Charakterisierung kleiner Proteine für den SPP2002 bereit. Wir haben umfangreiche Anpassungen einzelner Arbeitsschritte des Ribo-seq-Protokolls vorgenommen und in Zusammenarbeit mit den SPP-Gruppen Ribo-seq Datensätze für E. coli, Campylobacter jejuni, sowie sechs weitere bakterielle und zwei archeale Organismen generiert. Diese Datensätze bilden die Grundlage für die erste umfangreiche Erhebung kleiner ORFs (sORFs) in diesen Organismen. Neben weiteren Versuchsoptimierungen planen wir nun die Expression von sORFs mittels Ribo-seq unter verschiedenen Umwelt-, Stress- und Infektions-relevanten Bedingungen zu analysieren. Für C. jejuni haben wir außerdem Methoden zur Kartierung von Translationsinitiations- und Terminationsstellen etabliert (Ribo-TIS/TTS-seq), die nun für andere Organismen des SPP2002 angewendet werden können. Diese erweiterten Ribo-seq Ansätze können überlappende sORFs aufzeigen und die Zuverlässigkeit ihrer Annotationen erhöhen. Das Z2 Projekt hat in enger Zusammenarbeit mit den Wissenschaftlern den ersten Hochdurchsatz-Workflow für die Analyse prokaryotischer Ribo-seq-Daten (HRIBO) entwickelt. Im HRIBO-Workflow wurden die zwei im Vergleich besten bereits verfügbaren und auf Ribo-seq basierenden Programme zur Vorhersage von ORFs integriert. Die dadurch annotierten und vorhergesagten ORFs können dann auf differentielle Transkription und Translation untersucht werden. Da die verwendeten Tools die neuen Ribo-TIS/TTS Daten nicht verarbeiten können, werden wir Analysenwerkzeuge auf Basis von Verfahren des maschinellen Lernens erstellen, um die Vorhersage von ORFs noch weiter zu verbessen. Ein wichtiger Aspekt wird auch die sORF-Vorhersage in Archaeen sein, da die verfügbaren Tools für diese Organismen nur limitiert einsatzfähig sind. Unsere HRIBO Pipeline wird innerhalb des SPP einen gemeinsamen Analysestandard für Ribo-seq Daten bieten. Insgesamt wollen wir für die zweite Förderperiode des Z2 Projekts 1) Ribo-seq Methoden und Analysen für zusätzliche Organismen des SPP2002 ausbauen, 2) die Annotationen des Translatoms verfeinern, indem wir Methoden zur Kartierung der Translationsstarts-/ Stoppstellen etablieren und 3) die Methodik des Ribo-seq nutzen, um die Translation von sORFs unter ausgewählten Wachstums-, Stress- oder Infektionsbedingungen zu untersuchen. Zudem werden wir weiterhin sowohl experimentelle als auch bioinformatische Unterstützung und Training anbieten und sicherstellen, dass alle Methoden den Mitgliedern des SPP2002 mit hohem Standard und Reproduzierbarkeit zur Verfügung stehen.
DFG-Verfahren
Schwerpunktprogramme
