Understanding PinT, a noncoding RNA timer of virulence gene expression

• Antragsteller: Professor Dr. Jörg Vogel
• Fachliche Zuordnung: Parasitologie und Biologie der Erreger tropischer Infektionskrankheiten ; Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 369301476

Kleine RNA-Moleküle, sogenannte small RNAs (sRNAs), regulieren viele wichtige biologische Prozesse in Bakterien. Jedoch ist ihre Rolle für die bakterielle Virulenz aktuell unklar, weil es an sensitiven Modellsystemen fehlt. Mithilfe einer kürzlich neu entwickelten Analysemethode, der Dualen RNA-Sequenzierung, welche die Transkriptome eines Pathogens und seiner Wirtszelle parallel misst, haben wir PinT als die am stärksten während der Infektion einer Wirtszelle induzierte sRNA in Salmonellen identifiziert. Erste Studien haben gezeigt, dass eine Funktion von PinT darin besteht, die beiden wichtigesten Virulenzprogramme von Salmonellen zeitlich zu steuern. Darüber hinaus hat diese sRNA eine beispiellose Auswirkung auf die Wirtsantwort. Allerdings ist die volle Bedeutung von PinT aktuell ungewiss, ebenso wie die Mechanismen, welche der von PinT gesteuerten Regulationen zugrunde liegen, oder die molekularen Prinzipien ihrer Rolle für die Wirt-Pathogen-Wechselwirkung während der Infektion.Im Rahmen dieses Projekts werden wir PinT mittels verschiedener Methoden den vollen Umfang von PinT-Targets unter infektionsrelevanten Bedingungen bestimmen. Diese Targets werden anschließend mittels geeigneter Fluoreszenzreporter und Punktmutanten validiert. Die Mechanismen, welche der PinT-Regulierung zugrunde liegen, sowie die Rolle von PinT-Bindeproteinen für diese Funktionen, werden durch die Kombination von biochemischen Ansätzen wie RNA-Strukturanalyse mit in vitro-Assays bestimmt. Diese mechanistischen Studien werden durch Infektionsexperimente komplementiert um die Rolle von PinT für die Pathogen-Wirts-Interaktion zu verstehen. Darüber hinaus werden Duale RNA-Seq-Analysen in HeLa-Zellen und Schweine-Makrophagen durchgeführt werden um die Bedeutung der Wirtszellenumgebung für die von PinT-vermittelten zeitlichen Wechselwirkungen zwischen Salmonellen und dem Wirt zu erforschen. Um den Anteil spezifischer PinT-vermittelter Target-Regulationen zur gesamten Wirtsantwort zu bestimmen, werden wir einzelne PinT-Target-Interaktionen nacheinander blockieren und die jeweils resultierende Wirtsantwort mit der nach Infektion mit einer pinT-Deletionsmutante vergleichen. Insgesamt werden diese Experimente unser Verständnis der Rolle von PinT in der Virulenz von Salmonellen sowie der Interaktion mit der Wirtszelle deutlich verbessern. Darüber hinaus werden die hier beschriebenen Methoden auch für die Erforschung weiterer sRNAs in unterschiedlichen bakteriellen Pathogenen nützlich sein, welche nicht mittels gängiger genetischer Ansätze während der Infektion von Zellkultursystemen oder Tiermodellen erforschbar sind.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen